| 研究課題/領域番号 |
16590381
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
ウイルス学
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
神田 輝 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 助手 (50333472)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2005年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
2004年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
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| キーワード | EBウイルス / 潜伏感染 / EBNA1 / エピトープタグ / 蛍光免疫染色法 / FISH法 / 大腸菌人工染色体 / 遺伝子置換 / 転写調節 |
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| 研究概要 |
EBNA1蛋白質は、すべてのEBウイルス感染細胞内において発現し、ウイルスゲノムの複製と分配、ウイルス遺伝子の発現調節など様々な機能を発揮している。EBウイルス感染細胞内に低いレベルで発現するEBNA1蛋白質を感度良く検出するために、エピトープタグ付きEBNA1遺伝子を組み込んだ組換えEBウイルスゲノムを作製し、これを用いた解析を試みた。C末端に3コピーのHAタグを付加したEBNA1蛋白質をコードするEBNA1-HA3遺伝子を作製し、BAC(bacterial artificial chromosome)ベクターにクローン化したEBウイルスゲノムのEBNA1遺伝子をEBNA1-HA3遺伝子で置換した。このBACクローンのDNAをAkata細胞(バーキットリンパ腫由来)へトランスフェクションして、これをエピゾーム(環状DNA)として維持する細胞株を樹立した。抗HA抗体を用いた蛍光免疫染色法により、EBNA1-HA3蛋白質は核内にドット状に局在することが認められた。同じBACクローンのDNAをプローブとして用いたFluorescence in situ hybridization(FISH)法によりEBウイルスゲノムの局在を解析したところ、EBNA1-HA3蛋白質はEBウイルスゲノムと細胞周期を通じて共局在していた。同調培養した細胞を用いて同様の実験を行った結果、細胞周期のG2期核内でEBNA1蛋白質は近接したダブルドットとして局在すること、またダブルドットはG2期未成熟染色体凝縮標本において約50%の確率で姉妹染色体上に対称性に局在することを明らかにした。以上の結果より、EBNA1蛋白質を介して、複製したウイルスゲノムは姉妹染色体上へ均等分配されている可能性が示された。
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