| 研究課題/領域番号 |
16590452
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
病態検査学
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
高宮 脩 信州大学, 医学部, 教授 (50216785)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
2005年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
2004年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
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| キーワード | 第XI因子 / 分泌異常 / カルボキシ末端 / 遺伝子組み換え / カルボキシ-末端 / 凝固XI因子欠乏症 / XI因子遺伝子 / 遺伝子組み換え型XI因子 |
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| 研究概要 |
変異型第XI因子(FXIW599R)の分泌異常機構について検討した。
また、第XI因子分子の結晶構造のdatabaseを用いてCPグラフィックスによる変異型第XI因子の構造を検索した。第XI因子599位はC-末端のα-ヘリックスに位置し、ヒト以外にウサギ、マウス、ウシ、ラットの第XI因子に保存され、細胞分泌に構造上重要なアミノ酸であることが推定した。疎水性のW599が陽性荷電したRに置換することによってαヘリックスの外側にある側鎖に向かって新しい側鎖をつくり、その周りの構造が一部変化した。
正常肝臓由来のcDNAより制限酵素部位を付加したFXI cDNAを作成した。
患者に見い出したArgを含め、wild typeのFXI分子599位のTrpと異なった性状を有するGly、Glu、Pheに各々置換した変異型FXIを発現させるためにFXI599位変異型遺伝子/pcDNA3.1Zeoおよび野生型FXI遺伝子/pcDNA3.1Zeoを作成した。
これらのFXI遺伝子発現ベクター用いてCOS-1細胞で野生型および変異型FXIを一過性発現させた。変異型FXIは培養液中には分泌しなかったが細胞中のFXIagは野生型の60〜70%であった。また、CHO-K1による安定株を確立した。
Gene transcriptionおよびmRNA processingを確認するため、mRNAを定量したが、変異型は野生型FXIとほとんど差異はなかった。
SDS-PAGEで変異型FXIは野生型と同様に160Kdaに1本のバンドを出現した。Metabolic labeling studiesでFXIArg599は野生型に比べて、生合成が遅延するものと考えられた。
Tunicamycin、Castanosperin、Nojirimycin阻害は野生型FXIとほとんど差異はなかった。
、Lactacystin、Leupeptin阻害は野生型FXIとほとんど差異はなかったがBerfeldin A野生型FXIに比して減少した。
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