| 研究分担者 |
小嶋 哲人 名古屋大学, 医学部, 教授 (40161913)
高木 明 名古屋大学, 医学部, 助手 (30135371)
鈴木 元 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 講師 (80236017)
坂野 喜子 岐阜大学, 医学部, 助教授 (50116852)
野澤 義則 岐阜県国際バイオ研究所, 所長 (10021362)
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| 研究概要 |
1.血球系細胞におけるSPHK1の関与:ヒト白血病細胞株HL60のdbcAMP刺激による顆粒球系分化におけるSPHK1の関与を解析した。分化の過程においてSPHK1のメッセージ、およびタンパクレベルは上昇し、発現ベクターによる過剰発現により顆粒球系の分化カマーカーは増加した。SPHKの阻害剤によりdbcAMPによる文化課程を完全に阻害した。ERK1/2の阻害剤では文化課程は阻害されたがSPHK1活性は阻害しなかった。これらよりSPHK1がMEK/ERKの経路を介してこの系の分化を調節していることが明らかとなった。
2.神経系におけるSPHK1の関与:ウエスタンブロット法によりラット脳とPC12細胞にSPHK1の発現を確認した。PC12細胞を用いた解析では,NGFはSPHKの酵素活性の上昇を誘導し,SPHK1タンパクレベルをコントロールの約2倍に,メッセージレベルを約4倍にした。さらにPC12細胞を用いて主にexon1dの5'プロモーター領域の解析(約4kb)を行った。レポーターアッセイの結果から,NGFにより,SPHK1 exon1dのプロモーター活性は約6.1倍に上昇した。種々の阻害剤を用いて,NGFがSPHK1の転写活性を上昇させる経路を調べた結果,PKCとERKがSPHK1の遺伝子発現に関与していた。種々の長さのdeletion mutantを作製しプロモーター活性を測定した結果、転写に必要な領域は,領域内のAP-2と2つのSp1結合領域を含むexon1d上流50bpで十分であった。EMSAによる解析により,近位側Sp1結合領域がSp1タンパクと結合し,NGF誘導性のSPHK1 exon1d発現の上昇に関与していた。PC12細胞をNGF処理するとSp1自体の発現が増加することも確認できた。
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