レプリコンを用いたC型肝炎ウイルスNS5A蛋白の抗インターフェロン機構解析

• 研究課題/領域番号: 16590583
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 消化器内科学
• 研究機関: 山梨大学
• 研究代表者: 北原 史章 山梨大学, 大学院・医学工学総合研究部, 助手 (50303409)
• 研究分担者: 榎本 信幸 山梨大学, 大学院・医学工学総合研究部, 教授 (20251530) ; 坂本 穣 山梨大学, 大学院・医学工学総合研究部, 助手 (60324191)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円); 2005年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円); 2004年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
• キーワード: C型肝炎ウイルス / NS5A蛋白 / HCVレプリコン / インターフェロン / レプリコン / インターフェロン誘導遺伝子

研究概要

我々はC型肝炎ウイルス(HCV)における非構造蛋白NS5Aの構造がインターフェロン抵抗性、およびウイルス増殖を規定していることを明らかにしてきた(NS5A-ISDR;インターフェロン感受性決定領域)。しかしながら、HCV増殖におけるNS5Aの機能解析は、従来効率的な培養細胞におけるHCV複製系が存在しなかったことから困難であった。このような中で近年、細胞内における効率的な培養系であるHCVレプリコン系が開発された。一方、HCVレプリコンとして機能するHCV株は限られていたが、本研究において我々は新たなHCVレプリコンを日本で単離されたウイルス株、HC-J4株より独自に構築した。その結果、HC-J4株においても細胞内増殖するHCVレプリコンを構築可能なこと、一方レプリコンの増殖にはNS5Aの変異が必須なことを明らかとした。
次にインターフェロン治療効果の異なる症例から得られた様々なNS5A配列、あるいは臨床的解析からインターフェロン感受性に関連すると予想されたNS5Aにおける特定のアミノ酸変異を導入した様々なHCVレプリコンを作成し、レプリコンの増殖能変化について検討した。その結果、変異の導入によってHCV増殖効率は様々に変化したが、NS5A-ISDRに変異が多いほどレプリコン増殖能は高まった。さらに臨床的観察からインターフェロン増殖に強く関連すると予想された1アミノ酸変異の導入によってもレプリコン増殖は劇的に高められ、NS5Aの配列はin vivoとin vitroで強く関連していることが明らかになった。
さらに我々はHCVレプリコン増殖を可能にする細胞側因子を明らかにするため、ナイーブなHuh7細胞、レプリコン増殖細胞、およびインターフェロンによりレプリコンを除去したHuh7細胞において発現の異なる遺伝子群をマイクロアレイ等による網羅的解析によって検討した。その結果、レプリコン増殖細、レプリコン除去細胞において著明なインターフェロン誘導遺伝子群(ISG)の低下を認め、レプリコン増殖にはISGの低下が必須と考えられた。多数のISGのなかでHCV増殖制御に重要な遺伝子を明らかにするため、18種類のISG発現ベクターを作成し、個々の遺伝子のHCV増殖制御における役割を検討した。その結果、現在までに抗ウイルス効果を示す蛋白として報告のないIFI-6-16、GBP-1、IFI-27の3つの遺伝子が強い抗HCV効果を呈することが明らかとなった。

研究成果

• [雑誌論文] Site-specific mutation of the interferon sensitivity-determining region (ISDR) modulates hepatitis C virus replication (2006)
  • 著者名/発表者名: Kohashi T, Maekawa S, Enomoto N, et al.
  • 雑誌名: Journal of Viral Hepatitis
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Expressional screening of interferon-stimulated genes for antiviral activity against hepatitis C virus replication (2006)
  • 著者名/発表者名: Itsui Y, Sakamoto N, Enomoto N, et al.
  • 雑誌名: Journal of Viral Hepatitis
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Site-specific mutation of the interferon sensitivity-determining region (ISDR) modulate hepatitis C virus replication. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kohashi T, Maekawa S, Sakamoto N, Watanabe H, Tanabe Y, Chen C-H, Nakagawa M, Kakinuma S, Enomoto N, Watanabe M.
  • 雑誌名: J Viral Hepatitis in press
• [雑誌論文] Expressional screening of interferon-stimulated genes for antiviral activity against hepatitis C virus replication. (2006)
  • 著者名/発表者名: Itsui Y, Sakamoto N, Kurosaki M, Kanazawa N, Tanabe Y, Koyama T, Takeda Y, Nakagawa M, Kakinuma S, Sekine Y, Maekawa S, Enomoto N, Watanabe M
  • 雑誌名: J Viral Hepatitis in press
• [雑誌論文] Suppression of hepatitis C virus replication by cyclosporin A is mediated by blockade of cyclophilins. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa M, Sakamoto N, Enomoto N, et al.
  • 雑誌名: Gastroenterology 129(3) ページ: 1031-41
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Suppression of hepatitis C virus replication by cyclosporine A is mediated by blockade of cyclophilins. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa M, Sakamoto N, Tanabe Y, Koyama T, Itsui Y, Takeda Y, Chen CH, Kakinuma S, Oooka S, Maekawa S, Enomoto N, Watanabe M.
  • 雑誌名: Gastroenterology 129(3) ページ: 1031-1041
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Introduction of NS5A mutations enables subgenomic HCV replicon derived from chimpanzee-infectious HC-J4 isolate to replicate efficiently in Huh-7 cells (2004)
  • 著者名/発表者名: Maekawa S, Enomoto N, Sakamoto N, et al.
  • 雑誌名: Journal of Viral Hepatitis 11 ページ: 394-403
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Regulation of hepatitis C virus replication by interferon regulatory factor 1. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kanazawa N, Kurosaki M, Enomoto N, et al.
  • 雑誌名: Journal of Virology 78 ページ: 9713-20
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Introduction of NS5A mutations enables subgenomic HCV replicon derived from chimpanzee-infectious HC-J4 isolate to replicate efficiently in Huh-7 cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Maekawa S, Enomoto N, Sakamoto N, Kurosaki M, Ueda E, Kohashi T, Watanabe H, Chen CH, Yamashiro T, Tanabe Y, Kanazawa N, Nakagawa M, Sato C, Watanabe M.
  • 雑誌名: J Viral Hepat. 11 ページ: 394-403
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Regulation of hepatitis C virus replication by interferon regulatory factor 1. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kanazawa N, Kurosaki M, Sakamoto N, Enomoto N, Itsui Y, Yamashiro T, Tanabe Y, Maekawa S, Nakagawa M, Chen CH, Kakinuma S, Oshima S, Nakamura T, Kato T, Wakita T, Watanabe M.
  • 雑誌名: J Virol. 78 ページ: 9713-9720
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Specific inhibition of hepatitis C virus replication by cyclosporin A. (2004)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa M, Sakamoto N, Enomoto N, et al.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 313・1 ページ: 42-47
• [雑誌論文] Synergistic inhibition of intracellular hepatitis C virus replication by combination of ribavirin and interferon-alpha. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tanabe Y, Sakamoto N, Enomoto N, et al.
  • 雑誌名: J Infect Dis. 189・7 ページ: 216-223
• [雑誌論文] Changes of HCV quasispecies during combination therapy with interferon and ribavirin. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ueda E, Enomoto N, et al.
  • 雑誌名: Hepatol Res. 29・2 ページ: 89-96
  • NAID: 10018024225
• [雑誌論文] Regulation of hepatitis C virus replication by interferon regulatory factor 1. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kanazawa N, Kurosaki M, Sakamoto N, Enomoto N, et al.
  • 雑誌名: J Virol. 78・18 ページ: 9713-9720
• [雑誌論文] Introduction of NS5A mutations enables subgenomic HCV replicon derived from chimpanzee-infectious HC-J4 isolate to replicate efficiently in Huh-7 cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Maekawa S, Enomoto N, et al.
  • 雑誌名: J Viral Hepat. 11・5 ページ: 394-403
• [雑誌論文] Site-specific mutation of the interferon sensitivity-determining region (ISDR) modulates hepatitis C virus replication
  • 著者名/発表者名: Kohashi T, Maekawa S, Sakamoto N, Watanabe H, Tanabe Y, Chen C, Nakagawa M, Kakinuma S, Kurosaki M, Itsui Y, Koyama T, Takeda Y, Sekine Y, Enomoto N, Watanabe M.
  • 雑誌名: J Viral Hepat. (In press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Expressional screening of interferon-stimulated genes for antiviral activity against hepatitis C virus replication
  • 著者名/発表者名: Itsui Y, Sakamoto N, Kurosaki M, Kanazawa N, Tanabe Y, Koyama T, Takeda Y, Nakagawa M, Kakinuma S, Sekine Y, Maekawa S, Enomoto N, Watanabe M.
  • 雑誌名: J Viral Hepat. (In press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より