高効率複製系を用いたC型肝炎ウイルスの複製増殖機構の解析

• 研究課題/領域番号: 16590653
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 消化器内科学
• 研究機関: (財)東京都医学研究機構
• 研究代表者: 脇田 隆字 (財)東京都医学研究機構, 東京都神経科学総合研究所, 副参事研究員 (40280789)
• 研究分担者: 宮本 道子 (財)東京都医学研究機構, 研究員 (40190821) ; 加藤 孝宣 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 助手 (20333370)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 4,100千円 (直接経費: 4,100千円); 2005年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円); 2004年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
• キーワード: HCV / ウイルス / ウイルスゲノム複製 / 肝臓癌 / 慢性肝炎 / インターフェロン

研究概要

HCVは感染すると持続感染化し、慢性肝炎から肝細胞癌を発症する。その治療はいまだ不十分である。培養細胞によるHCVの良いウイルス培養系が無いことが新たな治療法の開発の妨げになってきた。これまでにない高い効率で培養細胞において複製可能なJFH-1株を用いて、ウイルスRNA複製系およびウイルス感染系を確立し、その機構を解析し、薪たな抗ウイルス戦略の構築に供することが本研究の目的である。
HCVの全長ウイルスゲノムをコードする構築の作製:
JFH-1株の全長ウイルスゲノムをプラスミドベクターのT7RNAプロモーターの下流に再構築した。この構築から全長のウイルスRNAを試験管内で合成した。
HCVの全長ウイルスRNAの培養細胞内での複製増殖:
試験管内で合成した全長のウイルスRNAをエレクトロポレーション法でHuh7細胞に導入する。ウイルスRNA導入後、経時的に細胞および培養上清を回収した。細胞内でHCV RNAが自律的に複製し、ウイルス粒子を培養液中に分泌した。培養上清をシュクロースまたはセシウムの密度勾配遠心により分画し、各分画中のウイルスRNAとコア蛋白質を定量した。ウイルス粒子の比重は約1.17g/mlであった。
HCVの全長ウイルスゲノムをもつレプリコン構築の作製
JFH-1株の全長ウイルスゲノムにネオマイシン耐性遺伝子を挿入したレプリコン構築を作製した。作製したレプリコンの構築から試験管内でRNAを合成して培養細胞に導入した。G418による選択培養を行いレプリコン複製細胞を得た。レプリコンRNAの複製を解析した。さらに、培養上清中のウイルス粒子形成を同定した。このレプリコンウイルス粒子を含む培養上清を新たな細胞に感染させることが可能であった。
HCVRNA複製のに関与するウイルス側因子の同定
HCV株のウイルス遺伝子領域を組み換えることによりウイルスRNA複製効率に影響するウイルス遺伝子領域を解析したところ、NS3、NS5Bから3'X領域が重要であることを見いだした。

研究成果

• [雑誌論文] Characterization of Genotype 2a Hepatitis C Virus Subgenomic Replicon in Comparison with Genotype 1b Replicon (2006)
  • 著者名/発表者名: M Miyamoto, et al.
  • 雑誌名: Intervirology 49 ページ: 37-43
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Production of infectious genotype 1a hepatitis C virus (Hutchinson strain) in cultured human hepatoma cell (2006)
  • 著者名/発表者名: Yi M, et al.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci USA 103(7) ページ: 2310-5
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Generation of infectious hepatitis C virus in immortalized human hepatocytes. (2006)
  • 著者名/発表者名: T Kanda, A Basu, R Steele, T Wakita, JS.Ryerse, R Ray, RB Ray.
  • 雑誌名: Journal of Virology (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Characterization of the replication sensitivity to cyclosporin A among strains of hepatitis C virus (2006)
  • 著者名/発表者名: N Ishii, K Watashi, T Hishiki, K Goto, D Inoue, M Hijikata, T Wakita, N Kato, K Shimotohno
  • 雑誌名: Journal of Virology (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Subcellular localization of hepatitis C virus structural proteins in a cell culture system that efficiently replicates the virus. (2006)
  • 著者名/発表者名: Y Rouille, F Helle, D Deigrange, P Roingeard, C Voisset, E Blanchard, S Belouzard, J McKeating, A Patel, G Maertens, T Wakita, C Wychowski, J Dubuisson
  • 雑誌名: Journal of Virology (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Production of infectious genotype is hepatitis C virus (Hutchinson strain) in cultured human hepatoma cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Yi M, Villanueva RA, Thomas DL, Wakita T, Lemon SM.
  • 雑誌名: Proc Nat Acad Sci USA. 103(7) ページ: 2310-2316
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Characterization of Genotype 2a Hepatitis C Virus Subgenomic Replicon in Comparison with Genotype 1b Replicon. (2006)
  • 著者名/発表者名: M Miyamoto, T Kato, T Date, M Mizokami, T Wakita.
  • 雑誌名: Intervirology 49 ページ: 37-43
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Non-Hepatic Cell Lines HeLa and 293 Cells Support Efficient Replication of Hepatitis C Virus Genotype 2a Subgenomic Replicon. (2005)
  • 著者名/発表者名: T Kato, et al.
  • 雑誌名: Journal of Virology 79 ページ: 592-596
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Nuclear Localization of Japanese Encephalitis Virus Core Protein Enhances Viral Replication (2005)
  • 著者名/発表者名: Y Mori, et al.
  • 雑誌名: Journal of Virology 79 ページ: 3448-58
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Characterisation of the E-138 (Glu/Lys) mutation in Japanese encephalitis virus using a stable full-length infectious cDNA clone (2005)
  • 著者名/発表者名: Zhao Z, et al.
  • 雑誌名: Journal of General Virology 86 ページ: 2209-2220
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Production of Infectious Hepatitis C Virus in Tissue Culture from a Cloned Viral Genome (2005)
  • 著者名/発表者名: T Wakita, et al.
  • 雑誌名: Nature Medicien 11 ページ: 791-796
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Robust Hepatitis C Virus Infection in Vitro (2005)
  • 著者名/発表者名: J Zhong, et al.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci USA 102 ページ: 9294-9299
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Robust production of infectious hepatitis C virus (HCV) from stably HCV cDNA-transfeted humanhepatoma cells (2005)
  • 著者名/発表者名: Cai Z, et al.
  • 雑誌名: Journal of Virology 79 ページ: 13963-73
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Detection of Anti-Hepatitis C Virus Effects of Interferon and Ribavirin by Sensitive Replicon System (2005)
  • 著者名/発表者名: T Kato, et al.
  • 雑誌名: Journal of Clinical Microbiology 43 ページ: 5679-84
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] 遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス(HCV)由来のRNAレプリコン (2005)
  • 著者名/発表者名: 脇田隆字
  • 雑誌名: バイオテクノロジージャーナル 5(3) ページ: 300-2
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] 宿主の新たな抗ウイルス活性によるB型肝炎ウイルス複製の抑制 (2005)
  • 著者名/発表者名: 脇田隆字
  • 雑誌名: Hepatoday 9 ページ: 6-7
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] 感染性C型肝炎ウイルス粒子の培養細胞における作製 (2005)
  • 著者名/発表者名: 脇田隆字
  • 雑誌名: 医学のあゆみ 215(11) ページ: 920-1
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] C型肝炎ウイルス培養細胞感染系の確立 (2005)
  • 著者名/発表者名: 加藤孝宣, 他
  • 雑誌名: ウイルス 55(2) ページ: 287-296
  • NAID: 10017102684
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] HCVレプリコン (2005)
  • 著者名/発表者名: 脇田隆字
  • 雑誌名: 肝臓 46(12) ページ: 691-702
  • NAID: 10020605421
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Detection of Anti-Hepatitis C Virus Effects of Interferon and Ribavirin by a Sensitive Replicon System (2005)
  • 著者名/発表者名: T Kato, T Date, M Miyamoto, M Sugiyama, Y Tanaka, E Orito, T Ohno, K Sugihara, I Hasegawa, K Fujiwara, K Ito, A Ozasa, M Mizokami, T Wakita.
  • 雑誌名: Journal of Clinical Microbiology 43 ページ: 5679-5684
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Robust production of infectious hepatitis C virus (HCV) from stably HCV cDNA-transfeted humanhepatoma cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Cai Z, Zhang C, Chang K-Y, Jiang J, Ahn B-C, Wakita T, Liang, JT, Luo G.
  • 雑誌名: Journal of Virology. 79 ページ: 13963-13973
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Robust Hepatitis C Virus Infection in Vitro (2005)
  • 著者名/発表者名: J Zhong, P Gastaminza, G Cheng, S Kapadia, T Kato, DR Burton, SF Wieland, S Uprichard, T Wakita, FV Chisari
  • 雑誌名: PNAS 2005 102 ページ: 9294-9299
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Production of Infectious Hepatitis C Virus in Tissue Culture from a Cloned Viral Genome (2005)
  • 著者名/発表者名: T Wakita, T Pietschmann, T Kato, T Date, M Miyamoto, Z Zhao, K Murthy, A Habermann, H-G Krausslich, M Mizokami, R Bartenschlager, T J Liang
  • 雑誌名: Nat Med. 11 ページ: 791-796
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Characterisation of the E-138 (Glu/Lys) mutation in Japanese encephalitis virus using a stable full-length infectious cDNA clone (2005)
  • 著者名/発表者名: Zhao Z, Date T, Li Y, Kato T, Miyamoto M, Yasui K, Wakita T.
  • 雑誌名: J.Gen.Virol. 86 ページ: 2209-2220
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Nuclear Localization of Japanese Encephalitis Virus Core Protein Enhances Viral Replication (2005)
  • 著者名/発表者名: Y Mori, T Okabayashi, T Yamashita, Z Zhao, T Wakita, K Yasui, F Hasebe, M Tadano, E Konishi, K Moriishi, Y Matsuura.
  • 雑誌名: J Virol. 79 ページ: 3448-3458
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Non-Hepatic Cell Lines HeLa and 293 Cells Support Efficient Replication of Hepatitis C Virus Genotype 2a Subgenomic Replicon. (2005)
  • 著者名/発表者名: T Kato, T Date, M Mivamoto, Z Zhao, M Mizokami, T Wakita
  • 雑誌名: J Virol 79 ページ: 592-596
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Robust production of infectious hepatitis C virus(HCV) from stably HCV cDNA-transfeted humanhepatoma cells (2005)
  • 著者名/発表者名: Cai Z, et al.
  • 雑誌名: Journal of General Virology 79 ページ: 13963-13973
• [雑誌論文] Detection of Anti-Hepatitis C Virus Effects of Interferon and Ribavirin by a Sensitive Replicon System (2005)
  • 著者名/発表者名: T Kato, et al.
  • 雑誌名: Journal of Clinical Microbiology 43 ページ: 5679-5684
• [雑誌論文] Non-Hepatic Cell Lines HeLa and 293 Cells Support Efficient Replication of Hepatitis C Virus Genotype 2a Subgenomic Replicon. (2005)
  • 著者名/発表者名: T Kato, T Date, M Miyamoto, Z Zho, M Mizokami, T Wakita
  • 雑誌名: Journal of Virology 79 ページ: 592-596
• [雑誌論文] Nuclear Localization of Japanese Encephalitis Virus Core Protein Enhances Viral Replication (2005)
  • 著者名/発表者名: Y Mori, T Okabayashi, T Yamashita, Z Zhao, t Wakita, et al.
  • 雑誌名: Journal of Virology 79 ページ: 3448-3458
• [雑誌論文] Genotype 2a Hepatitis C Virus Subgenomic Replicon Can Replicate in HepG2 and IMY-N9 cells (2004)
  • 著者名/発表者名: Date T, et al.
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 279 ページ: 22371-6
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Regulation of Hepatitis C Virus Replication by Interferon Regulatory Facctor-1 (2004)
  • 著者名/発表者名: Kanazawa N, et al.
  • 雑誌名: Journal of Virology 78 ページ: 9713-20
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Difference of Hepatitis C Virus Core Protein Processing between Genotypes 1 and 2. (2004)
  • 著者名/発表者名: T Kato, et al.
  • 雑誌名: Hapatology Research 30 ページ: 204-209
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] HCV repliconに関する研究 (2004)
  • 著者名/発表者名: 脇田隆字
  • 雑誌名: 臨床消化器内科 19 ページ: 1545-7
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] HCV repliconによるHCV RNA複製 (2004)
  • 著者名/発表者名: 脇田隆字
  • 雑誌名: 細胞 36・7 ページ: 293-6
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Difference of Hepatitis C Virus Core Protein Processing between Genotypes 1 and 2. (2004)
  • 著者名/発表者名: T Kato, M Miyamoto, T Date, A Furusaka, M Mizokami, T Wakita
  • 雑誌名: Hepatology Research 30 ページ: 204-209
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Regulation of Hepatitis C Virus Replication by Interferon Regulatory Facctor-1 (2004)
  • 著者名/発表者名: Kanazawa N, Kurosaki M, Sakamoto N, Enomoto N, Itsui Y, Yamashiro T, Tanabe Y, Maekawa S, Nakagawa M, Chen C-H, Oshima S, Nakamura T, Kato T, Wakita T, Watanabe M
  • 雑誌名: J Virol 78 ページ: 9713-9720
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Genotype 2a Hepatitis C Virus Subgenomic Replicon Can Replicate in HepG2 and IMY-N9 cells (2004)
  • 著者名/発表者名: Date T, Kato T.Mivamoto M, Zhao Z, Yasui K, Mizokami M, Wakita T.
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 279 ページ: 22371-22376
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Genotype 2a Hepatitis C Virus Subgenomic Replicon Can Replicate in HepG2 and IMY-N9 cells (2004)
  • 著者名/発表者名: Date T, Kato T, Miyamoto M, Zhao Z, Yasui K, Mizokami M, Wakita T
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 279 ページ: 22371-22376
• [雑誌論文] Regulation of Hepatitis C Virus Replication by Interferon Regulatory Facctor-1 (2004)
  • 著者名/発表者名: Kanazawa N, Kurosaki M, Sakamoto N, et al.
  • 雑誌名: Journal of Virology 78 ページ: 9713-9720