| 研究課題/領域番号 |
16590783
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
腎臓内科学
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
竹田 徹朗 新潟大学, 医歯学総合病院, 助手 (10361924)
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| 研究分担者 |
斉藤 亮彦 (斎藤 亮彦) 新潟大学, 大学院・医歯学総合研究科, 客員助教授 (80293207)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
2005年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
2004年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
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| キーワード | 腎糸球体 / 蛋白質相互作用 / リン酸化蛋白 / アダプター蛋白 / 糸球体上皮細胞 |
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| 研究概要 |
糸球体上皮細胞の頂側に発現している陰性荷電分子ポドカリキシンは、アダプター蛋白(エズリン、NHERF2)と連関して腎糸球体の濾過に関与していることを証明するため以下の検討を行った。
1 ポドカリキシン/NHERF2/エズリン分子のリン酸化状態と糸球体障害との関係
正常および腎臓病モデルラットの糸球体よりそれぞれの蛋白を精製し、リン酸化蛋白を検出するシステムを用いて病的状態でのリン酸化の変動を検討した。病的状態ではエズリンは脱リン酸化を受け、同時に複合体から解離していた。
2 アダプター蛋白NHERF2のPDZ1に結合する蛋白の同定
酵母2ハイブリッドシステムと糸球体由来cDNAライブラリーを用いて、NHERF2のPDZ1領域cDNAをbaitとしてスクリーニングを行った。得られたクローンはNHERF2のPDZ1そのものであった。GST pull-down法と免役共沈によりNHERF2のPDZ1同士が結合することを確認した。病的状態の糸球体においてはその結合が減弱していた。
3 培養糸球体上皮細胞の形質評価
Dr.Mundelにより樹立された温度感受性糸球体上皮細胞が生体内の糸球体上皮細胞と同様の機能を発現しているかを評価した。ハイマン腎炎責任抗原メガリンが分化状態の同細胞に発現し、かつエンドサイトーシス受容体として生体内と同様に機能していることを確認した。
4 同細胞におけるポドカリキシン・アダプター蛋白の相互作用に対するアンジオテンシンIIの効果
AII、AII拮抗薬添加の有無によりポドカリキシンと免疫共沈するアダプター蛋白量を検討したところ、AII依存的にこれらの複合体が解離することが明らかとなった。
5 ポドカリキシンの強制発現によるアダプター蛋白・アクチン複合体の再構築
MDCK培養細胞にポドカリキシンを強制発現させるとアダプター蛋白の再構築(頂側への再分布)を認めた。また、細胞内骨格のシグナルに関与するRhoAが活性化していた。これらよりポドカリキシンを強制発現するとRhoAの活性化を介してアダプター蛋白の再分布が行われると考えられる。
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