| 研究課題/領域番号 |
16590902
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
内分泌学
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
加納 安彦 名古屋大学, 環境医学研究所, 助手 (50252292)
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| 研究分担者 |
村田 善晴 名古屋大学, 環境医学研究所, 教授 (80174308)
高岸 芳子 名古屋大学, 環境医学研究所, 助手 (50024659)
妹尾 久雄 名古屋大学, 環境医学研究所, 教授 (40135380)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
2005年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
2004年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
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| キーワード | 甲状腺ホルモン不応症 / 甲状腺ホルモン受容体 / コアクチベーター / 酵母Two-Hybridシステム / cDNA / クローニング |
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| 研究概要 |
甲状腺ホルモン不応症発症の原因となる変異を持つ甲状腺ホルモン受容体(TR)β特異的アクチベーターの同定に向けた第一段階として、酵母Two-Hybridシステムを用いてT_3依存的にTRβに結合するタンパクをコードするcDNAのクローニングを試みた。
【方法】
全長ヒトTRβ1 cDNAをGAL4 DNA結合ドメインを持ったベクター(pGBKT7)に組み込み(TR/BDプラスミド)、これをBaitとして酵母Two-Hybridシステムによりヒト肝臓cDNAライブラリー(AD/cDNAライブラリー、Clonthech社製)をスクリーニングした。
【結果】
1)1次スクリーニングによって131個のクローンを得たが、2次スクリーニング後にT_3依存的に成育したクローンは91個で、これまでに74クローンの部分配列を決定した。しかし、11クローンは液体培地中で成育しなかったため、偽陽性と判断した。部分塩基配列を決定した74クローンは、データベース検索した結果、26種類に分類できた。
2)上記26種類のうち、機能未知のクローンNo.60とNo.93について全長cDNAをクローニングした。No.60には3種類のmRNAが存在し、演繹されるアミノ酸配列からいずれも核内タンパクであり、DNA結合活性を持つ可能性がある.これら3種類の全長cDNAをクローニングした。No.93は1種類のみのcDNAをクローニングした.
次に、クローニングしたcDNAがコードするタンパクが実際にTRと結合するかをin vitroで検討するために、TRをGST融合タンパクとして、クローン60,93のタンパクをHis tagとの融合タンパクとして発現させてpull-downアッセイを行う予定である。すでに、各々を大腸菌で発現させるためのベクターを構築した。
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