| 研究課題/領域番号 |
16591521
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
整形外科学
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| 研究機関 | 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪府立成人病センター(研究所) |
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研究代表者 |
山村 倫子 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪府立成人病センター(研究所), 研究所, 主任研究員 (50342994)
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| 研究分担者 |
高橋 克仁 大阪府立成人病センター, 研究所, 部長 (40211338)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
3,800千円 (直接経費: 3,800千円)
2005年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2004年度: 2,700千円 (直接経費: 2,700千円)
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| キーワード | ヘルペスウイルス / カルポニン / ウイルス療法 / 遺伝子治療 / 肉腫 / GM-CSF / GMP基準 |
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| 研究概要 |
健常人の白血球よりRNAを抽出し、PCR法でヒトGM-CSFの全長cDNAをクローニングした。ヒトカルポニン遺伝子のプロモーター(+73〜-260bp)を、単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)ウイルスの複製開始に必須な転写因子をコードするICP4遺伝子の上流に挿入し、さらにその上流に標識遺伝子lacZを、その下流にInternal Ribosomal Entry Site(IRES)とヒトGM-CSF cDNA を連結した相同組換えベクターpKX2βG3-CALP-ICP4-GM-CSFを構築した。このDNA断片をICF)4欠失HSV変異体c/120のRibonucleotide reductase(RR, ICP6)-locusに相同組み換え法を用いて挿入し、ICP4とRRの二重欠失変異体をスクリーニングした。SK-LMS-1平滑筋肉腫細胞でlacZの発現を指標にしてスクリーニングし、続いてICP4をトランスフェクションしたVero細胞(VeroE5)を用いて3回スクリーニングを繰り返し、3クローンの単一の相同組換え体を得た。
無血清培地VP-SFM (Invitrogen)とVeroE5を用いて、まずd12.CALPΔRRウイルスを用いて増殖を1%CS/DMEM培地と比較した。感染後24時間までは、無血清、血清培地ともに同程度の増殖を示した。培養液にすべて無血清培地を用いても、d12.CALPΔRRの精製は可能であり、〜10^9PFUにまで濃縮可能であった。無血清培地を用いて精製した。d12.CALPΔRRは、平滑筋肉腫に対する細胞傷害活性、GCV感受性など、血清存在下で精製したロットと変わりはなかった。
化学発癌繊維肉腫細胞株MethAを同系のC57BL/6マウスに移植し、この肉腫に対し細胞傷害 作用をもつd120変異体ウイルスを感染させ、腫瘍消極後26-97日でMethAを再度移植し、活性化Tリンパ球の誘導と腫瘍の拒絶を確認した。
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