ヒト角膜内皮細胞の再生医療に関する基礎研究

• 研究課題/領域番号: 16591764
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 眼科学
• 研究機関: 獨協医科大学
• 研究代表者: 妹尾 正 獨協医科大学, 医学部, 教授 (50206653)
• 研究分担者: 千葉 桂三 獨協医科大学, 医学部, 講師 (60146181) ; 寺田 理 獨協医科大学, 医学部, 助手 (50326881) ; 石丸 慎平 獨協医科大学, 医学部, 助手 (80406214) ; 小原 喜隆 国際医療福祉大学, 保健学部, 教授 (70048354) ; 菊池 通晴 (菊地 通晴) 獨協医科大学, 医学部, 助手 (30382972)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円); 2005年度: 800千円 (直接経費: 800千円); 2004年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
• キーワード: 願角膜内皮細胞 / 細胞周期タンパク / E2Fファミリー / 角膜内皮 / 培養増殖 / 細胞周期関連因子 / 細胞周期抑制因子

研究概要

1)プロモーター領域をもつルシフェラーゼ、GFPをエレクトロポーレーターで遺伝子導入した結果、今回の実験系では通電圧25V、パルス幅20ms、パルス間隔100ms、回数8回が最も遺伝子効率良かった。これ以降の遺伝子導入実験はすべて、この設定条件で遺伝子導入を行なった。
2)予めクローニングしておいたG1ポイントのバイパス因子であるE2FファミリーcDNA(E2F2、E2F1)をエレクトロポーレーターで遺伝子導入した。細胞周期の進行は、Ki67の発現で調べた。その結果、家兎角膜内皮細胞では、E2F1、E2F2ともに増殖期の細胞がそれぞれ23%、30%増加した。また、アメリカ・アイバンクアイを用いた人角膜の実験では、E2F1遺伝導入部位でKi67遺伝子の発現が認められ、細胞周期が後期G1から進行したことを示した。しかし、M期まで進行した細胞はごくわずかで、G2期で抑制を受けたか、S期でアポトーシスが誘導された可能性があった。E2F2も同様にKi67遺伝子の発現が認められ細胞周期が後期G1から進行したことを示した。E2F1よりはM期まで進行した細胞が多かったものの遺伝子導入の効率はE2F1より低く5%に満たなかった。今後この点については再検討してゆく必要がある。一方で、アポトーシスの誘導も示唆されており、この点はどのぐらいの確立で誘導されたかを再検討してゆくつもりである。
3)現在、E2FファミリーがRbタンパクの脱リン酸化を受けて開放されたあと、DP1と結合後核内に誘導を受けることから,DP1遺伝子導入およびDP1とE2Fとの同時導入によって細胞周期の変化を検索中である。家兎角膜を用いた基礎実験を現在行っているが、この実験結果を踏まえて、ヒト角膜内皮細胞を用いて同様の実験を行うつもりである。