研究課題
基盤研究(C)
本年度はカスパーゼ8のメチル化解析の実験を行う上で、昨年度までの研究を更に進め以下のとおり実施した。(1)これまで当科にて保存したDNA検体に加え、購入したMagtration System 6GCを用い当科に保存してある神経芽細胞腫組織からDNAを抽出した。(2)抽出した腫瘍、対照として末梢血リンパ球DNA各約50例を、INTERGEN CpGenome DNA Modification Kitを使用してbisulfate処理をおこなった。(3)Bisulfate処理したGenomeを現有するサーマルサイクラーを用いてPCRにかけ増幅する。PCR産物を現有するハイブリステーションを用いて試作したメチル化特異的DNAオリゴアレイにハイブリダイズさせ、caspase8の5'flanking regionの6箇所についてメチル化の有無を判定した。腫瘍組織はstage1が13例中17箇所、stage2が9例中7箇所,stage3が9例中17箇所,stage4が12例中31箇所,stage4sが7例中10箇所にメチル化が見られた。リンパ球ではstage1が14例中1箇所、stage2が4例中2箇所,stage3が9例中0箇所,stage4が13例中4箇所,stage4sが5例中1箇所にメチル化が見られた。(4)PCR産物を精製し準備調整したPrimerを用いてPCRをかけ増幅した。(5)現有するシークエンサーを用いてDNAシークエンスを解析した。オリゴアレイでの腫瘍組織のメチル化判定結果と300箇所中262箇所で同一判定を得た。(6)判定の異なるサンプルに対し、TAクローニングを行い、得られたクローンに対しオリゴアレイ、シークエンス解析を行った。各クローンのメチル化にばらつきが見られた。(7)サンプルのうち一部でcDNAを作成し、TaqMan PCR法を用い、カスパーゼ8の発現状態を解析し、オリゴアレイ結果を検証した。Stage別での比較ではstage1とstage4について発現量に有意差が見られた。
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