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ATP及びGTPの細胞内動態解析用センサーの開発

研究課題

研究課題/領域番号 16591858
研究種目

基盤研究(C)

配分区分補助金
応募区分一般
研究分野 機能系基礎歯科学
研究機関徳島大学

研究代表者

野間 隆文  徳島大学, 大学院・ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (40189428)

研究分担者 堀口 大吾  徳島大学, 大学院・ヘルスバイオサイエンス研究部, 助手 (70304532)
研究期間 (年度) 2004 – 2005
研究課題ステータス 完了 (2005年度)
配分額 *注記
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2005年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
2004年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
キーワードFRET / アデニル酸キナーゼ / ATP / アデニンヌクレオチド / アイソザイム / ミトコンドリア / ミトコンドリア膜間
研究概要

細胞内でのATPの動態をリアルタイムで検出するための道具として、FRETの原理を応用し大腸菌アデニル酸キナーゼ(AK)を利用したATPセンサーの開発を試みた。
まず、蛍光標識の方法を検討し、大腸菌AKの一カ所のアミノ酸をトリプトファンに置換し、これをFRETのドナーとし、一方、AKに一カ所しか存在しないシステイン残基を蛍光標識して、これをFRETのアクセプターとする方針を決定した。次に、大腸菌AKをコードする遺伝子を発現ベクターにつなぎ、AKタンパク質が発現することを確認した。さらに、この発現ベクターを鋳型として、PCRによりAKに変異を導入し、得られた発現ベクターからの三種類のAK変異体の発現誘導も確認した。これらの変異体が活性を有しているかどうか、まずCV2株にトランスフォームして検討した。CV2株は温度感受性であり、外部から活性のあるAKが供給されなければ、42℃で成育することはできない。調べた結果、いずれの変異体も42℃で成育可能であり、アデニル酸キナーゼ活性を有している可能性が示唆された。次に、野生型、および変異型のAKタンパク質の精製法を検討し、最終的に、Blue SepharoseカラムとDE53カラムとを組み合わせることで、95%以上の純度のAKタンパク質を得ることに成功した。最後にこれら、精製したタンパク質のアデニル酸キナーゼ活性を測定したところ、野生型に対して、二種類の変異体はおよそ70%程度の活性を、残る一種類は約30%程度の活性を有していることがわかった。これはいずれの変異体も程度の差はあれ、野生型に近い三次構造を維持していることを示唆している。
今後は、これらのタンパク質のシステイン残基に蛍光標識をして、その標識体が三次構造を維持していることを確認し、さらに基質結合の有無で、発する蛍光スペクトルが変化することを確認する予定である。

報告書

(3件)
  • 2005 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 2004 実績報告書
  • 研究成果

    (1件)

すべて 2005

すべて 雑誌論文 (1件)

  • [雑誌論文] Dynamics of nucleotide metabolism as a supporter of life phenomena.2005

    • 著者名/発表者名
      Noma, T.
    • 雑誌名

      The Journal of Medical Investigation 52

      ページ: 127-136

    • NAID

      110002272890

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2005 実績報告書 2005 研究成果報告書概要

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公開日: 2004-04-01   更新日: 2016-04-21  

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