| 研究課題/領域番号 |
16591912
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
保存治療系歯学
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
田代 陽子 岡山大学, 医学部・歯学部附属病院, 助手 (20362981)
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| 研究分担者 |
伊澤 俊次 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助手 (20273998)
鳥井 康弘 岡山大学, 医学部・歯学部附属病院, 教授 (10188831)
高畑 安光 岡山大学, 医学部・歯学部附属病院, 助手 (10362980)
吉山 昌宏 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (10201071)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
2005年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2004年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
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| キーワード | 孤束核 / 最後野 / ドーパミン受容体 / RT-PCR / 免疫組織化学 / in situ hybridization / ラット / ドーパミン受容体mRNA / 免疫染色 |
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| 研究概要 |
【RT-PCR実験】
7週齢、雄のS.D.ラットを用い延髄の前額断スライスから孤束核、最後野を摘出し、RNAの抽出を行った。さらに精製RNAについて逆転写反応を行い、標的プライマー(ドーパミンサブタイプD1からD5に対する)を用いて、PCRを行った。その結果孤束核にドーパミン受容体サブタイプD2mRNAが、最後野にD2及びD5mRNAの存在が明らかになった。
【免疫染色実験】
このRT-PCR実験結果を踏まえ、孤束核および最後野に発現するドーパミン受容体タンパク質の局在を調べた。すなわち、孤束核および最後野を含む延髄凍結切片を作製しその切片を用いて、ドーパミン受容体サブタイプD2あるいはD5に対する抗体を用いて免疫染色を行った。その結果、孤束核にドーパミン受容体サブタイプD2の、最後野にドーパミン受容体サブタイプD2,D5の存在が明らかになった。
【in situ hybridization実験】
さらに、ドーパミンD2,D5受容体mRNAの生体組織内局在を調べるために、最後野、孤束核を含む厚さ10μmの延髄前額断凍結切片を作製した。PCR産物を大腸菌を用いてクローニングし、精製プラスミドDNAを転写合成しジゴキシゲニン標識RNAプローブを作製し用いた。ハイブリダイゼーションは、50℃で約20時間湿箱内にて反応させた。免疫学的検出には、アルカリフォスファターゼ標識、抗ジゴキシゲニン抗体を用い、室温で30分反応させBCIP、NBTで、遮光下で5〜12時間反応させた。対比染色には、2%メチルグリーンを用い、Pristine Mountで封入し実体顕微鏡下で観察した。その結果、ドーパミンD2,D5受容体mRNAが最後野に、ドーパミンD2受容体mRNAの局在が孤束核に認められた。これまでの研究では中脳側坐核においてD2ドーパミン受容体がstress-induced-analgesiaに関与していることがわかっているが、今回の実験で最後野にもD2ドーパミン受容体が存在することが明らかになった。
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