in vivoナノ蛋白質工学による神経伝達物質受容体活性化の可視化解析

• 研究課題/領域番号: 16650083
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 神経化学・神経薬理学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 森 泰生 京都大学, 工学研究科, 教授 (80212265)
• 研究分担者: 浜地 格 京都大学, 工学研究科, 教授 (90202259) ; 原 雄二 京都大学, 工学研究科, 助手 (60362456) ; 清中 茂樹 京都大学, 工学研究科, 助手 (90422980) ; 宇山 浩 大阪大学, 工学研究科, 教授 (70203594) ; 下野 健 アルファメッドサイエンス(株), 主任研究員
• 研究期間 (年度): 2004 – 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円); 2005年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円); 2004年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
• キーワード: 光アフィニティーラベル化 / バイオセンサー / アセチルコリン受容体 / プロテオミクス / 免疫抑制剤

研究概要

昨年度は、in vivoナノタンパク質工学を目的として開発された光アフィニティーラベル化後修飾法が未知の薬の作用部位同定法として利用できることを報告した。
今年度は、実際にその有効性を確認するために、我々が新たに同定した従来とは異なる作用を有する免疫抑制剤の作用部位同定にこの手法を応用した。
まず、免疫抑制剤の作用部位をある程度推測するために、カルシウムイオンの流入阻害について検討した。カルシウムイメージングを利用した結果からこの薬が受容体刺激後のCa2+流入を阻害することを確認できた。流入経路はTRPCチャネルと呼ばれるチャネルであると考えられたので、各サブタイプに対する選択性についてHEK293細胞を用いた評価した。その結果、この薬はTRPC3のチャネル活性を選択的に抑制できることを見出せた。さらにホールセルモードのパッチクランプ法を用いることで、細胞外からこの薬はチャネル活性を阻害することも確認できた。
TRPC3に直接この薬が作用していることを証明するために、本申請内容で提案したアフィニティーラベル化後修飾法を利用した。具体的には、この薬に対応するアフィニティーラベル化剤を有機合成し、TRPC3を過剰発現させたHEK293細胞に作用させた。光照射後に細胞膜画分を回収し、ラベル化後の選択的な修飾反応としてビオチン修飾を行った。反応進行をウェスタンブロッティングにて確認したところ、TRPC3に選択的に反応していることを確認でき、この免疫抑制剤がTRPC3に直接結合している証拠を得ることができた。
以上の結果から、本研究において開発した光アフィニティーラベル化後修飾法が受容体可視化だけでなく、未知の薬の作用部位同定法としても利用できることを実証した。

研究成果

• [雑誌論文] Ca^<2+>/calmodulin dependent myosin light chain kinase is essential for activation of TRPC5 channels expressed in HEK cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Shimizu S, Yoshida T, Wakamori M, Ishii M, Okada T, Takahashi M, Seto M, Sakurada K, Kiuchi Y, Mori Y
  • 雑誌名: J.Physiol. 570 ページ: 219-235
• [雑誌論文] Comprehensive analysis of the ascidian genome reveals novel insights into the molecular evolution of ion channel genes (2005)
  • 著者名/発表者名: Okamura Y, Murata Y, Nakajo K, Iwasaki I, Ohtsuka Y, Tanaka-Kunishima M, Takahashi N, Hara Y, Yoshida T, Nishida M, Okado H, Watari H, Meinertzhagen IA, Nishino A, Satoh N, Takahashi K, Satou Y, Okada Y, Mori Y
  • 雑誌名: Physiological Genomics 222 ページ: 269-282
• [雑誌論文] The non-selective cation permeating channel TRPC3 is a tetrahedron with a cap in the large cytoplasmic end (2005)
  • 著者名/発表者名: Mio K, Ogura T, Hara Y, Mori Y, Sato C
  • 雑誌名: Biochem.Biophys.Res.Comm. 333 ページ: 768-777
• [雑誌論文] The role of canonical transient receptor potential 7 (TRPC7) in B-cell receptor-activated channels. (2005)
  • 著者名/発表者名: Lievremont J-P, Numaga T, Vazquez G, Lemonnier L, Hara Y, Mori E, Trebak M, Trebak M, Moss SE, Bird GS, Mori Y, Putney Jr JW
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280 ページ: 35346-35351
• [雑誌論文] Novel real time sensors to quantitatively assess in vivo inositol 1,4,5-trisphosphate production in intact cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Sugimoto K, Nishida M, Otsuka M, Ohkubo K, Mori Y, Morii T.
  • 雑誌名: Chem.Biol. 11 ページ: 475-485
• [雑誌論文] Ca^<2+> store-independent augmentation of [Ca^<2+>]i responses to G-protein coupled receptor activation in recombinantly TRPC5-expressed rat pheochromocytoma (PC12) cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ohta T, Morishita M, Mori Y, Ito S.
  • 雑誌名: Neurosci.Lett. 358 ページ: 161-164
• [雑誌論文] Mutations in EFHC1 cause juvenile myoclonic epilepsy. (2004)
  • 著者名/発表者名: Suzuki T, et al.Mori Y, Yamakawa K.
  • 雑誌名: Nat.Genet. 36 ページ: 842-846
• [雑誌論文] Involvement of TRPM7 in cell growth as spontaneously activated Ca^<2+> entry pathway in human retinoblastoma cells. (2004)
  • 著者名/発表者名: Hanano T, Hara Y, Shi J, Itonaga Y, Mori E, Ito Y, Mori Y, Inoue R.
  • 雑誌名: J Pharmacol.Sci. 95 ページ: 403-419
  • NAID: 10014165738
• [雑誌論文] Polyglutamine repeats of spincerebellar ataxia 6 impair the cell death-preventing effect of Cav2.1 Ca^<2+> channel. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yanagisawa N, Aoki Y, Black III JL, Lennon VA, Mori Y, Imoto K, Inuzuka T, Matsuyama Z.
  • 雑誌名: Neurobiol.Disease 17 ページ: 198-204
• [雑誌論文] Activation of RASGRP3 by phosphorylation of Thr133 is required for BCR-mediated Ras activation. (2004)
  • 著者名/発表者名: Aiba Y, Oh-hora M, Kiyonaka S, Kimura Y, Hijikata A, Mori Y, Kurosaki T.
  • 雑誌名: Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 101 ページ: 16612-16617
• [雑誌論文] Phoneutria nigriventer ω-Phonetoxin IIA : A new tool for anti-calcium channel autoantibody assays in Lambert-Eaton myasthenic syndrome.
  • 著者名/発表者名: Martin-Moutot N, Haro LD, Santos RG, Mori Y, Seagar M
  • 雑誌名: Neurobiol.Dis. (in press)
• [雑誌論文] Intracellular-produced hydroxyl radical mediates H_2O_2-induced TRPM2 channel activation and cell death in rat β-cell line RIN-5F.
  • 著者名/発表者名: Ishii M, Shimizu S, Hara Y, Hagiwara T, Miyazaki A, Mori Y, Kiuchi Y
  • 雑誌名: Cell Calcium (in press)
• [雑誌論文] A functional AMPA receptor-calcium channel complex in the postsynaptic membrane.
  • 著者名/発表者名: Kang, MG, Chen CC, Wakamori M, Hara Y, Mori Y, Campbell KP
  • 雑誌名: Proc.Natl.Acad.Sci.USA (in press)
• [雑誌論文] A critical role of TRPM2 in neuronal cell death by hydrogen peroxide
  • 著者名/発表者名: Kaneko S, Kawakami S, Hara Y, Itoh E, Minami T, Takada Y, Kume T, Katsuki H, Mori Y, Akaike A
  • 雑誌名: J Pharmacol.Sci. (in press)
  • NAID: 10018237407
• [図書] Ca channel pharmacology book (2004)
  • 著者名/発表者名: Mori Y, Itsukaichi Y, Nishida M, Oka H.