ストレス応答のシステム生物学:出芽酵母GCN経路のリアルタイム計測

• 研究課題/領域番号: 16651095
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 基礎ゲノム科学
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 伊藤 隆司 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 教授 (90201326)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 3,100千円 (直接経費: 3,100千円); 2005年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円); 2004年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
• キーワード: アミノ酸 / センサー / FRET / HisJ / EYFP / ECFP

研究概要

本研究の目的は、ストレス応答のシステム生物学的解析への第一歩として、出芽酵母の栄養ストレス応答を制御するGCNパスウェイの挙動をリアルタイムに計測できる実験系を構築することにある。具体的には、GCN経路の出力である細胞質内のアミノ酸濃度の実時間計測を行なうことを目指して、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を利用したセンサーの開発に取り組んだ。
センサーの骨格としては、大腸菌のペリプラズム結合蛋白質HisJを用いた。HisJは2つのローブからなる蛋白質で、ヒスチジンと結合すると、コンフォメーションの変化が起こり、ローブの位置関係が変化する。そこでN末とC末に黄色蛍光蛋白質YFPとシアン蛍光蛋白質CFPを付加しておくと、FRETの変化が起こると期待される。この考えに基づいて、YFP-HisJ-CFPを作成したところ、ヒスチジンの添加とともにFRETが減少してゆくセンサーを開発することに成功した。
更に細胞質内のヒスチジン濃度に合致したKdを持つように変異を導入したところ、Glnに対しても親和性を持つことが判明した。そこで、ドッキングシミュレーションを用いてGlnの結合様式を予測し、それに基づく変異導入でGlnには殆ど結合せず、生理的な濃度のHisに応答できるセンサーの開発に成功した。
このセンサーを用いて倍地中のHisの変化に応じた細胞質Hisの変化の計測に成功した。しかしながら、内因性の蛍光物質が培地中に蓄積することから、培養液そのものを用いた蛍光計測が困難である。現在、これを回避する為に励起-蛍光波長が長波長側にずれたセンサーの開発を試みている。

研究成果

• [雑誌論文] Transcriptional activators in yeast (2006)
  • 著者名/発表者名: Titz, B., Thomas, S., Rajagopala, S., Chiba, T., Ito, T., Uetz, P.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res. 34 ページ: 955-967
• [雑誌論文] Lessons from comparative analysis of species-specific imprinted genes (2006)
  • 著者名/発表者名: Okamura, K., Ito, T.
  • 雑誌名: Cytogenet. Genome Res. 113(印刷中)
• [雑誌論文] A novel strategy to design highly specific PCR primers based on the stability and uniqueness of 3'-end subsequences (2005)
  • 著者名/発表者名: Miura, E., Uematsu, C., Sakaki, Y., Ito, T.
  • 雑誌名: Bioinformatics 21 ページ: 4363-4370
• [雑誌論文] A yeast one-hybrid system to detect methylation-dependent DNA-protein interactions. (2004)
  • 著者名/発表者名: Feng, S.-Y.et al.
  • 雑誌名: Biochem.Biophys.Res.Commun. 313 ページ: 922-925
• [雑誌論文] A comprehensive analysis of allelic methylation status of CpG islands on human chromosome 21q. (2004)
  • 著者名/発表者名: Yamada, Y. et al.
  • 雑誌名: Genome Res. 14 ページ: 247-266
• [雑誌論文] Barrier proteins remodel and modify chromatin to restrict silenced domains. (2004)
  • 著者名/発表者名: Oki, M.et al.
  • 雑誌名: Mol.Cell.Biol. 24 ページ: 1956-1967
• [雑誌論文] Analysis of gene network regulating yeast multidrug resistance by artificial activation of transcription factors : involvement of Pdr3 in salt resistance. (2004)
  • 著者名/発表者名: Onda, M. et al.
  • 雑誌名: Gene 332 ページ: 51-59
• [雑誌論文] Transcriptomic and proteomic analysis of a 14-3-3 gene-deficient yeast. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ichimura, T. et al.
  • 雑誌名: Biochemistry 43 ページ: 6149-6158
• [雑誌論文] Mass spectrometry-based proteomics for quantitative description of cellular events. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kito, K., Ito, T.
  • 雑誌名: Curr.Genomics 5 ページ: 629-635