外有毛細胞蛋白プレスチンの膜電位-細胞長変換の分子機構及び膜機能蛋白との機能協関

• 研究課題/領域番号: 16659053
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 生理学一般
• 研究機関: 生理学研究所
• 研究代表者: 久保 義弘 生理学研究所, 分子生理研究系, 教授 (80211887)
• 研究期間 (年度): 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円); 2005年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円); 2004年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
• キーワード: プレスチン / 外有毛細胞 / ゲート電流 / 細胞収縮 / 構造機能連関 / 細胞長変化 / 単粒子構造解析 / バキュロウイルス

研究概要

内耳の外有毛細胞は、膜電位変化に伴い伸縮しその細胞長を変える。10kHz超という驚異的に直速の膜電位変化にまで細胞長伸縮が追従するため、その機構は長く関心の的であった。2000年に、膜電位を細胞長に変換する分子として、陰イオントランスポーターSLC26ファミリーに属する分子"プレスチン"が同定された。「プレスチンによる膜電位-細胞長変換の分子機構とその生理的意義を明かにする」というゴールへ向けて、本研究では、プレスチン分子の単粒子構造解析を行うことを具体的目標として、その蛋白の精製を行った。プレスチンのN-もしくはC-末端にFLAG tagを付加したコンストラクトの作成、baculo virusベクターへの組み換えを行い、昆虫細胞Sf9に感染させることにより高タイターのbaculo virusを得た。また、プレスチンを認識する特異抗体の作成にも成功し、この抗体、およびFLAG抗体を用いて、Sf9細胞における発現を解析したところ、非常に強く細胞膜上に発現していることが確認された。感染Sf9細胞のストックをlarge scaleで作り、膜画分蛋白を、FLAG affinityカラム、および、ゲルろ過カラムで精製した。ゲル電気泳動し、銀染色およびWestern blottingにより精製を確認したところ、十分な収量の精製産物が得られていたが、かなりのaggregationが起きていた。今後、この点を克服するために、detergentの種類、pH緩衝剤の種類、溶液のイオン強度、glycerolやsucroseの添加濃度等の精製条件について系統的に検討すると共に、lipidの添加による蛋白の安定化も試みる。十分なクオリティーの精製蛋白が得られ次第、単一粒子構造解析に進む計画である。

研究成果

• [雑誌論文] Dual signaling is differentially activated by different active states of the metabotropic glutamate receptor1a. (2006)
  • 著者名/発表者名: Tateyama, M., Kubo, Y.
  • 雑誌名: Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103 ページ: 1124-1128
• [雑誌論文] Functional roles of charged amino acid residues on the wall of the cytoplasmic pore of Kir2.1. (2006)
  • 著者名/発表者名: Fujiwara, Y., Kubo, Y.
  • 雑誌名: Journal of General Physiology (印刷中)
• [雑誌論文] Towards a view of functioning dimeric metabotropic receptors (2005)
  • 著者名/発表者名: Kubo, Y., Tateyama, M.
  • 雑誌名: Current Opinion in Neurobiology 57 ページ: 509-526
• [雑誌論文] OPA1 expression in the normal rat retina and optic nerve. (2005)
  • 著者名/発表者名: Ju, W.K., Misaka, T., Kushnareva, Y., Nakagomi, S, Agarwal, N., Kubo, Y.et al.
  • 雑誌名: Journal of Comparative Neurology 488 ページ: 1-10
• [雑誌論文] Visualization of the trimeric P2X2 receptor with a crown-capped extracellular domain. (2005)
  • 著者名/発表者名: Mio, K., Kubo, Y., Ogura, T., Yamamoto, T., Sato, C.
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 337 ページ: 998-1005
• [雑誌論文] Protein Kinase C shifts the voltage-dependence of KCNQ/M channels expressed in Xenopus oocytes. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nakajo, K., Kubo, Y.
  • 雑誌名: Journal of Physiology 569 ページ: 59-74
• [雑誌論文] Ligand-induced rearrangement of the intracellular dimeric conformation of metabotropic glutamate receptor 1a. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tateyama, M., Abe H., Nakata, H., Saitoh, O., Kubo, Y.
  • 雑誌名: Nature Structural & Molecular Biology 11 ページ: 637-642
• [雑誌論文] Density Dependent Changes of the Pore Properties of P2X_2 Receptor (2004)
  • 著者名/発表者名: Fujiwara, Y., Kubo, Y.
  • 雑誌名: journal of Physiology 558 ページ: 31-43
• [雑誌論文] Biochemical and Physiological Analyses of the RGS8 function (2004)
  • 著者名/発表者名: Saitoh, O., Kubo, Y.
  • 雑誌名: Methods in Enzymology 390 ページ: 129-148