| 研究課題/領域番号 |
16659064
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| 研究種目 |
萌芽研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
薬理学一般
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
助川 淳 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (30187687)
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| 研究分担者 |
倉増 敦朗 東北大学, 大学院・医学系研究科, 講師 (90302091)
柳澤 輝行 東北大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (90133941)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
2005年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
2004年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
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| キーワード | 細胞表面受容体 / 内在化 / エンドサイトーシス |
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| 研究概要 |
細胞表面受容体の過剰な活性発現は、細胞の癌化や高血圧症など種々の病態の原因になっており、従来薬物治療の標的として注目されてきた。本研究は、疾病にかかわる特定の受容体の局在性や総量を、受容体ソーティングの機能を利用し人為的に調節することを目的とした。すなわち、受容体内在化のトリガーになる可能性を持つタンパク質を細胞の内部から当該受容体にターゲティングさせ、受容体分子を強制的に内在化させる事を試みた。モデル受容体としては、チロシンキナーゼ活性を持つErbB2受容体と、Gタンパク質共役型受容体である1型アンジオテンシンII受容体を使用した。
1.予備実験として、ErbB2受容体の内在化を促進すると考えられるcblと受容体分子との融合タンパク質を培養細胞系で発現させた。融合タンパク質の細胞内局在を蛍光抗体法により観察したところ、細胞表面発現が減少し、細胞内にエンドソームに一致する当該タンパク質の凝集像が認められ、受容体分子の細胞内ソーティングに影響を与えていることが確認された。
2.ErbB2受容体、および1型アンジオテンシンII受容体の細胞質内ドメインを大腸菌で発現させ、マウス腹腔に投与免疫した。免疫血清を用いたウエスターン法により、良好な特異的抗体の産生を確認した。
3.免疫マウスの脾臓からRNAを精製し、抗体遺伝子cDNAをRT-PCR法にて合成増幅し、ファージディスプレイ法を利用し、一本鎖抗体をファージ表面に発現するライブラリーを作成した。
4.一本鎖抗体発現ファージライブラリーから、受容体細胞質内ドメインと反応するクローンの分離を試みたが成功に至っていない。そのため、免疫マウスの脾臓を利用し、受容体細胞質内ドメインに特異的な抗体を産生するハイブリドーマを作成し、その特異的抗体遺伝子から一本鎖抗体を作成すべく、実験を継続中である。
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