| 研究課題/領域番号 |
16659359
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| 研究種目 |
萌芽研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
消化器外科学
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
松本 拓也 九大, 大学病院, 助手 (20374168)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
3,300千円 (直接経費: 3,300千円)
2005年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
2004年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
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| キーワード | BubR1 / 老化 / ジーンタゲティング / BubR1 hypomorphic mouse |
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| 研究概要 |
BubR1の老化に対する分子機構を解析するため、我々はジーンタゲティングの手法を用いBubR1の低下したマウス(BubR1 hypomorphic mouse)を作製し、BubR1の分子機構を詳細に検討することを今年度の目的とした。
pMC1neo遺伝子をイントロンに逆方向に挿入することによって、遺伝子発現を減少させたマウスを作製することとした。ターゲティングベクターの構築にはファージ-プラスミド間組み換え法を用いて行った。我々は、BubR1の機能ドメイン領域をコードするゲノムDNA断片をプローブとして用い、BubR1の機能ドメイン領域を含むλファージクローンをλTKライブラリー(ターゲテッイング構築ライブラリー)より単離した(λTK-BubR1)。DNAシークエンス解析を行った結果、BubR1のIntron 4より下流14.8KbpのゲノムDNAを含むことが判った。
遺伝子発現低下を目的としたターゲテッイングベクター構築には、pMC1neo遺伝子カセットをIntron 5の中央部分に逆方向に配したπANλ-pMC1neo-BubR1プラスミドを構築し、大腸菌に導入した。このプラスミドを保持する大腸菌に先程単離したλTK-BubR1ファージクローンを感染させた。ファージ-プラスミド間組み換えによりpMC1neoの組み込まれたλTK-pMC1neo-BubR1のゲノム(15.9Kbp)を単離した。このゲノムをNotlで切り出したターゲティングベクターをエレクトロポレーション(電気穿孔)法でES細胞に導入した。サザンブロットにより相同組み換え体のスクリーニングを行いこれまでに7つのpositive clonesを単離している。
現在positive ES cellsを偽妊娠マウスにinjection予定である。
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