マイクロダイセクション法によるセメント質・歯根膜に特異的な遺伝子の同定と機能解析

• 研究課題/領域番号: 16689034
• 研究種目: 若手研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 歯周治療系歯学
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 近藤 尚知 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助教 (70343150)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 21,710千円 (直接経費: 16,700千円、間接経費: 5,010千円); 2006年度: 7,150千円 (直接経費: 5,500千円、間接経費: 1,650千円); 2005年度: 9,490千円 (直接経費: 7,300千円、間接経費: 2,190千円); 2004年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)
• キーワード: レーザーキャプチャー / マイクロダイセクション / 硬組織非脱灰凍結切片 / In-situ hybrydizstion / ノックアウトマウス / セメント質 / 歯根膜 / マイクロアレイ / 凍結切片

研究概要

レーザーキャプチャー顕微鏡を用いたマイクロダイセクションシステム(LCM)は、顕微鏡観察下において組織切片から単一の標的細胞集団のみを正確に採取して、その標的細胞からのRNA抽出を可能にした画期的なシステムである。そして、その分離採取された各細胞集団から得られたRNAを比較解析すれば、それぞれに特異的なマーカーを同定することも可能だと考え、LCMが可能な骨と歯牙を含む硬組織非脱灰凍結切片の作成を試みた。硬組織非脱灰凍結切片から抽出したRNAは28Sおよび18Sのピークが明確で、RT-PCR解析においても明瞭なオステオカルシン、GAPDHなどのバンドが確認され、RNAのクウォリティの高さを示唆する結果が得られた。続いて、LCMにより抽出されたRNAを増幅後、マイクロアレイ解析を行った結果、解析した約40000個の遺伝子のうち、2000個以上に発現レベルの差を認めた。上記のように、セメント質および歯根膜組織等の硬組織の遺伝子配列の解析が可能なRNA抽出法が確立され、組織特異的なマーカーの検索と機能解析が可能となった。セメント質に発現が強いものを順次選択し、定量的RT-PCR法によるスクリーニングを行った。LCMで得られるRNAの収量はきわめて少ないため、そして大腿骨・頚骨には歯周組織は含まれないことから、セメント(+)/歯根膜(-)/顎骨(+)/大腿骨(-)の遺伝子は、セメント質に関連するものである可能性が高いと仮定して、PCR解析には上記の組織を用いた。引き続き、In-situ hybrydizstion法によって、各遺伝子の局在を検索した。そして、上記遺伝子のうちのひとつの発現は、ヘルトビッヒの上皮鞘に特異的であることが明らかになり、歯根形成への関与が強く示唆された。この遺伝子の真の機能を検索するため、ノックアウトマウスの作出を計画し、ターゲティングベクターの設計を行った。

研究成果

• [雑誌論文] Comparative Analysis of Gene Expression between Cementrum and Periodontal Ligament (2008)
  • 著者名/発表者名: H. KONDO, Y. YOKOYAMA, Y. DATE, T. DAMRONGRUNGRUANG, M. ODA, S. KURODA, S. SIEKI, K. OHYA, and S. KASUGAI
  • 雑誌名: Journal of Dental Research, Special Issue A (In press)
• [雑誌論文] Comparative analysis of gene expression by cDNA microarray between cementoblasts and periodontal ligament cells in the murine mandible (2008)
  • 著者名/発表者名: Yoshiko Yokoyama, Shinji Kuroda, Teerasak Damrongrungruang, Yoshiro Takano, Keiichi Ohya, Shohei Kasugai and Hisatomo Kondo
  • 雑誌名: The Jouranl of Oral Bioscience (In press)50巻3号
  • NAID: 10027104050
• [雑誌論文] レーザーキャプチャー顕微鏡を用いたマウス・セメント芽細胞および歯根膜細胞における遺伝子発現の比較検討 (2008)
  • 著者名/発表者名: 横山佳子(指導:近藤尚知、春日井昇平)
  • 雑誌名: 口腔病学会雑誌 75巻1号 ページ: 13-28
• [雑誌論文] A New Technique with Calcium Phosphate Precipitate Enhance Efficiency In Vivo Plasmid DNA Gene Transfer. (2005)
  • 著者名/発表者名: Shinji Kuroda, Hisatomo Kondo, Keiichi Ohya, Shohei Kasugai
  • 雑誌名: Journal of Pharmacological Science 97-2 ページ: 227-233
  • NAID: 10025726087
• [雑誌論文] Bone Regeneration by Modified Gene-Activated Matrix ; Effectiveness in Segmental Tibial Defects in Rats. (2005)
  • 著者名/発表者名: Masaki Endo, Shinji Kuroda, Hisatomo Kondo, et al.
  • 雑誌名: Tissue Engineering In press
• [雑誌論文] Application of Laser Capture Microdissection on Periodontal Tissue. (2005)
  • 著者名/発表者名: H.KONDO, T.DAMRONGRUNGRUAG, Y.TAJIRIKA, et al.
  • 雑誌名: Journal of Dental Research (in press)
  • NAID: 130004456580
• [雑誌論文] A New Technique Using Calcium Phosphate Precipitate Enhances Efficiency of In Vivo Plasmid DNA Gene Transfer (2004)
  • 著者名/発表者名: S.KURODA, H.KONDO, S.KASUGAI, et al.
  • 雑誌名: Journal of Bone and Mineral Research 18(Suppl.2)