| 研究概要 |
ネオカルジリン生合成遺伝子クラスター中に存在する新規ハロゲン化酵素遺伝子の機能同定を目的として、本遺伝子の大量発現系の構築を行った。前年度までに様々なタグ融合タンパクとしての発現や大腸菌ホストの検討、誘導条件の検討を行ったが芳しい結果は得られなかった。今年度は異種放線菌発現系の構築を試みたが、こちらも芳しい結果は得られなかった。唯一、大腸菌発現系でシャペロンと共発現した場合に目的タンパク質が一部可溶性画分に分画されることを見出した。また、不溶化した発現タンパクのリフォールディングも試み、一部のタンパクが可溶化することを見いだした。
調製した発現ハロゲン化酵素と種々基質を反応し、基質特異性を検討した。基質候補化合物であるデクロロネオカルジリン、5-フェニル3,5-ジオキソペンタン酸を合成し、発現したハロゲン化酵素、フラビン還元酵素とインキュベートし、反応物をHPLCで分析した。また1,3-アセトンジカルボン酸、ジメチル1,3-アセトンジカルボン酸およびL-トリプトファンについても同様に検討した。その結果いずれの基質を用いた場合も反応前と反応後で有意な差は認められず、これらはハロゲン化酵素に基質として認識されないことが示唆された。もっとも有力な気質候補化合物と考えられた(12S, 6E, 8E, 10E)12-methyl-3,5-dioxo-6,8,10-tetradecatrienoic acidの合成も検討しているが、現段階で全合成には至っていない。しかしもう一つの有力な基質候補化合物であるデクロロネオカルジリンが基質として認識されなかったことから、12-methyl-3,5-dioxo-6,8,10-tetradecatrienoic acidが本来のハロゲン化酵素の基質である可能性が高いと考えられる。
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