抗体遺伝子再構成を行ったB細胞を検出する新規可視化法の確立

研究課題

研究課題/領域番号	16760637
研究種目	若手研究(B)
配分区分	補助金
研究分野	生物機能・バイオプロセス
研究機関	岡山大学
研究代表者	曲正樹岡山大学, 大学院自然科学研究科, 助手 (50359882)
研究期間 (年度)	2004 – 2005
研究課題ステータス	完了 (2005年度)
配分額 *注記	3,700千円 (直接経費: 3,700千円) 2005年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円) 2004年度: 2,700千円 (直接経費: 2,700千円)
キーワード	抗体遺伝子再構成 / RAG / 蛍光タンパク / レトロウイルスベクター
研究概要	本研究では、抗体遺伝子再構成を行った細胞の標識方法の開発を行った。抗体遺伝子再構成は、様々なリンパ球の分化段階で行われ、また、それぞれが一過性におこなわれるためそれらを厳密に評価することが困難である。そこで、分化段階別に、厳密に組み換え活性をモニターする方法を確立することを目的とした。方法としては、抗体遺伝子再構成を触媒するrecombination activating gene (RAG)の認識配列である、Recombination signal sequence (RSS)と2種類の蛍光タンパク遺伝(EGFP,DsRed2)を用いてRAGの人工基質を作成し、様々な培養細胞株に遺伝子導入し、抗体遺伝子再構成の活性を可視化することとした。この人工基質は、プロモーターの下流にEGFPとDsRed2を互いに逆方向に配置し、その両端に互いに逆方向にRSS配列を配置した。このシステムでは、RAGが発現するとRSS間の遺伝子の反転がおこるため、緑色蛍光から赤色蛍光へのが変化する。以後、このベクターを抗体遺伝子再構成を行った細胞を検出するための人工基質として用いることとした。昨年度までに、マウス繊維芽細胞において、RAGの発現に依存して蛍光タンパク遺伝子の反転と共に、蛍光タンパクの変化を観察することが出来た。そこで、実際に様々なマウス脾臓B細胞株や胸腺種細胞に人工基質を導入し、その蛍光タンパクの発現について検討した。その結果、RAGの発現に依存して、赤色蛍光を観察することが出来た。これらの蛍光の変化を遺伝子レベルで解析したところ、遺伝子レベルでも人工基質の反転が起きていた。以上の結果より、本システムは抗体遺伝子再構成についての検討するために有用な方法である。