膜タンパク質の非天然状態の構造・物性と巻戻り中間体測定システムの構築

• 研究課題/領域番号: 16770111
• 研究種目: 若手研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 生物物理学
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 園山 正史 名古屋大学, 大学院工学研究科, 助教授 (40242242)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 2,600千円 (直接経費: 2,600千円); 2006年度: 600千円 (直接経費: 600千円); 2005年度: 600千円 (直接経費: 600千円); 2004年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
• キーワード: タンパク質 / 膜タンパク質 / 天然構造 / 非天然構造 / フォールディング / 安定性 / 巻き戻り / バクテリオオプシン / 非天然状態 / 機能中間体 / 変性中間体 / 赤外分光 / ラマン分光

研究概要

タンパク質の構築原理解明を最終的な目的として、膜タンパク質の代表的な基本構造である7本膜貫通ヘリックスをもつバクテリオロドプシン(bR)を対象に、本来機能の発現を引き起こす可視光照射が、光退色という機能不全につながることが報告されている、非天然状態の構造・物性、およびバクテリオオプシン(bO)からの再生に関する研究を行ってきた。本年度は、非天然状態に関する研究では、中性リン脂質Dimyristoylphosphatidylcholine(DMPC)に再構成したbRについて、レーザーフラッシュフォトリシスを用いて光機能サイクルを調べた。脂質二重膜がゲル相にある5℃では、bRの光サイクルは天然紫膜に類似したものであったが、液晶相に相当する30℃では、中間体の生成、消滅に顕著な違いが見られた。特に、プロトン移動に関連する、タンパク質の大きな構造変化が予想されるM中間体において、興味深い挙動が見られた。今後のさらに精密な実験と解析により、合成脂質膜中にある非天然bRの光サイクルの特徴を明らかにすることが期待できる。
bOとレチナールの混合によるbR再生実験では、静電相互作用の遮蔽の影響を見るために、最終的な再生率および再生killeticsにおける塩(NaCl)濃度依存性を調べた。最終的な再生率は、いずれの塩濃度においてもほぼ一定であった。一方、再生の速度論的解析によると、いずれの場合も再生は2つの異なる速度成分で記述できるが、塩濃度の増加に伴い、遅い成分が増えることがわかった。遅い成分に対応すると考えられる、bO分子の構造揺らぎを考慮した解析を、現在さらに試みている。

研究成果

• [雑誌論文] Heterogeneity in regeneration of bacteriorhodopsin from bacterio-opsin and all-trans retinal at high temperatures. Implications for dynamic structural fluctuations (2006)
  • 著者名/発表者名: H.Sugiyama, M.Sonoyama, G.D.Ghimire, S.Mitaku
  • 雑誌名: Biosci. Biotech. Biochem. 70・6 ページ: 1350-1350
  • NAID: 10018529921
• [雑誌論文] Rarnan spectroscopic study on the L-type straight flagellar filament of Salmonella (2006)
  • 著者名/発表者名: T.Uchiyama, M.Sonoyarna, Y.Hamada, M.Komatsu, R.K.Dukor, L.A.Nafie, K.Oosawa
  • 雑誌名: Vib. Spectrosc. 42・2 ページ: 192-194
• [雑誌論文] Structures of 17, 19-hexatriacontadiyne monolayers on Au(111) studied by infrared reflection absorption spectroscopy and scanning tunneling microscony (2006)
  • 著者名/発表者名: O.Endo, T.Furuta, H.Ozaki, M.Sonoyama, Y.Mazaki
  • 雑誌名: J. Phys. Chem. B 110・26 ページ: 13100-13106
• [雑誌論文] In-situ observation of tiyptophan in larval cocoon silk of the hornet Vespa simillima xanthoptera Cameronby by ultraviolet resonance Raman spectroscopy (2006)
  • 著者名/発表者名: T.Karneda, T.Niizeki, M.Sonoyama
  • 雑誌名: Biosci. Biotech. Biochern. (印刷中)
• [雑誌論文] Heterogeneity in regeneration of bacteriorhodopsin from bacterio-opsin and all-trans retinal at high temperatures. Implications for dynamic structural fluctuation. (2006)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama, H.et al.
  • 雑誌名: Biosci.Biotech.Biochem. (印刷中)
• [雑誌論文] Photobleaching of bacteriorhodopsin solubilized with Triton X-100 (2005)
  • 著者名/発表者名: Sasaki, T.et al.
  • 雑誌名: Photochem.Photobiol. 81 ページ: 1131-1137
• [雑誌論文] Regeneration of bacteriorhodopsin from thermally unfolded bacterio-opsin and all-trans retinal at high temperature (2005)
  • 著者名/発表者名: Ghimire, G.D.et al.
  • 雑誌名: Biosci.Biotech.Biochem. 69 ページ: 252-254
• [雑誌論文] Regeneration of bacteriorhodopsin from thermally unfolded bacterio-opsin and all-trans retinal at high temperature (2005)
  • 著者名/発表者名: G.D.Ghimire et al.
  • 雑誌名: Biosci.Biotech.Biochem. 69・1 ページ: 252-254
• [雑誌論文] Electric charge balance in extended soluble proteins (2005)
  • 著者名/発表者名: N.Uchikoga et al.
  • 雑誌名: Protein Sci. 14・1 ページ: 74-80
• [雑誌論文] High-temperature intermediate state of bacteriorhodopsin prior to the pre-melting transition of purple membrane revealed by reactivity with hydrolysis reagent hydroxylamine (2004)
  • 著者名/発表者名: M.Sonoyama, S.Mitaku
  • 雑誌名: J.Phys.Chem.B. 108・50 ページ: 19496-19500
• [雑誌論文] Isomerization of retinal chromophore and conformational changes in membrane protein bacteriorhodopsin by solubilization with a mild non-ionic detergent, n-octyl-β-glucoside : An FT-Raman and FT-IR spectroscopic study (2004)
  • 著者名/発表者名: M.Sonoyama et al.
  • 雑誌名: Vib.Spectrosc. 35・1-2 ページ: 115-119
• [雑誌論文] Inhomogeneous stability of bacteriorhodopsin in purple membrane against photobleaching at high temperature (2004)
  • 著者名/発表者名: Y.Yokoyama et al.
  • 雑誌名: Proteins : Structure, Function, and Bioinformatics 54・3 ページ: 442-454
• [雑誌論文] Influence of cholesterol on thermotropic behavior of phospholipid membranes that contain dimyristoylphosphatidylcholine and sphingomyelin (2004)
  • 著者名/発表者名: M.Shibakami et al.
  • 雑誌名: J.Phys.Soc.Jpn. 73・12 ページ: 3484-3488