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GO期特異的に形成されるp27巨大複合体の解析

研究課題

研究課題/領域番号 16770138
研究種目

若手研究(B)

配分区分補助金
研究分野 細胞生物学
研究機関東北大学

研究代表者

石田 典子  東北大学, 大学院医学系研究科, 助手 (10361073)

研究期間 (年度) 2004 – 2005
研究課題ステータス 完了 (2005年度)
配分額 *注記
3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
2005年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
2004年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
キーワードタンパク質 / 細胞周期 / CDKインヒビター / p27 / GO期 / タンパク質安定化
研究概要

GO期特異的に形成されるp27巨大複合体構成因子の同定・機能解析を目標として本研究を行った。p27は細胞増殖の抑制を引き起こす負の調節因子であり、GO期から細胞周期に再進入する際にタンパク質分解により発現量が急速に減少する、重要な鍵分子である。このp27のSer10部位をAlaに置換した非リン酸化型ノックインマウスを作製・解析したところ、本来非常に安定であるGO期にp27タンパク質が不安定化し、p27発現量が低下することが明らかとなった。予備実験の結果、GO期にp27は巨大な複合体を形成すること、その巨大複合体の形成は増殖シグナルであるPI3キナーゼ活性によって阻害されることが明らかとなり、その結果p27が不安定化することが示唆された。本研究ではこのGO期特異的なp27の巨大複合体プロテオミクスを行い、その構成因子を明らかにすることを試みた。
まず293T細胞にFLAGタグを付加したp27を発現させ、PI3Kインヒビター処理により細胞周期を停止させた細胞に特異的に結合する分子群を、抗FLAG抗体カラムを用いて濃縮し、p27複合体プロテオミクスを行った。その結果、30種類弱のタンパク質をPI3Kインヒビター存在下のp27結合分子として同定することに成功した。残念ながらこれらp27結合分子の多くは既知であり、残りの結合因子について解析した結果、これらの中にもGO期においてp27と複合体を形成する分子群を見出すことは出来なかった。そこで癌細胞株の使用を止め、GO期に停止させた正常細胞を用いてその細胞抽出液をサイズ分画後、高分子分画に存在する内在性p27の複合体解析を試みた。この高分子分画に含まれるp27結合分子をSDS-PAGE後に銀染色したところ、特異的な5本のバンドが存在することが明らかとなり、これら5つの構成因子を同定中である。当初の目的は達成されていないが、方法に関しては確立しており、複合体の構成因子も可視化出来ているため、まもなく同定出来ると考えている。その後は機能解析まで進める予定である。

報告書

(2件)
  • 2005 実績報告書
  • 2004 実績報告書
  • 研究成果

    (8件)

すべて 2005 2004

すべて 雑誌論文 (8件)

  • [雑誌論文] Molecular dissection of the interaction between p27 and KPC, the ubiquitin ligase That regulates proteolysis of p27 in G1 Phase.2005

    • 著者名/発表者名
      Kotoshiba S. et al.
    • 雑誌名

      J. Biol. Chem. 280・18

      ページ: 17694-17700

    • 関連する報告書
      2005 実績報告書
  • [雑誌論文] Role of serine 10 phosphorylation in p27 stabilization revealed by analysis of p27 knock-in mice harboring a serine 10 mutation.2005

    • 著者名/発表者名
      Kotake, Y. et al.
    • 雑誌名

      J. Biol. Chem. 280・2

      ページ: 1095-1102

    • 関連する報告書
      2005 実績報告書
  • [雑誌論文] Molecular dissection of the interaction between p27 and KPC, the ubiquitinligase that regulates proteolysis of p27 in G1 phase.2005

    • 著者名/発表者名
      Kotoshiba S. et al.
    • 雑誌名

      J.Biol.Chem. (発表予定)

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [雑誌論文] Skp2-mediated degradation of p27 regulates progression into mitosis.2004

    • 著者名/発表者名
      Nakayama, K. et al.
    • 雑誌名

      Dev.Cell 6

      ページ: 661-672

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [雑誌論文] Cytoplasmic ubiquitin ligase KPC regulates proteolysis of p27Kip1 at G1 phase.2004

    • 著者名/発表者名
      Kamura, T, et ai.
    • 雑誌名

      Nature Cell Biol. 6

      ページ: 1229-1235

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [雑誌論文] Phosphorylation-dependent degradation of c-Myc is mediated by the F-box protein Fbw7.2004

    • 著者名/発表者名
      Yada, M. et al.
    • 雑誌名

      EMBO J. 23

      ページ: 2116-2125

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [雑誌論文] Mouse Fbw7/Sel-10/Cdc4 is required for Notch degradation during vascular development.2004

    • 著者名/発表者名
      Tsunematsu, R. et al.
    • 雑誌名

      J.Biol.Chem. 279

      ページ: 9417-9423

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [雑誌論文] Role of serine 10 phosphorylation in p27 stabilization revealed by analysis of p27 knock-in mice harboring a serine 10 mutation.2004

    • 著者名/発表者名
      Kotake Y. et al.
    • 雑誌名

      J.Biol.Chem. 280

      ページ: 1095-1102

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書

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公開日: 2004-04-01   更新日: 2016-04-21  

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