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リン酸化プロテオーム解析によるERK及びROCKの基質の網羅的同定と機能解析

研究課題

研究課題/領域番号 16770141
研究種目

若手研究(B)

配分区分補助金
研究分野 細胞生物学
研究機関東京大学

研究代表者

小迫 英尊  東京大学, 医科学研究所, 寄付研究部門教員 (10291171)

研究期間 (年度) 2004 – 2005
研究課題ステータス 完了 (2005年度)
配分額 *注記
3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
2005年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
2004年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
キーワードMAPキナーゼ / プロテオミクス / リン酸化 / 核膜孔 / ヌクレオポリン / 核内輸送 / ダイニン / 2D-DIGE / IMAC / 網羅的解析 / ERK / 質量分析計 / 二次元電気泳動
研究概要

本研究では、様々な細胞内シグナル伝達で鍵となるプロテインキナーゼであるERKとROCKをモデル系とし、その細胞内基質群を網羅的に同定するための新たなリン酸化プロテオーム解析法を開発して、得られた新規基質のリン酸化による機能制御を解明することを目標としている。これまでに、IMACによる全タンパク質からのリン酸化タンパク質の精製法と蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動(2D-DIGE)技術を併用することにより、ERK/MAPキナーゼ経路に位置するリン酸化タンパク質を33種類同定することに成功した。本年度は特に、この中に含まれていた核膜孔複合体の構成因子(ヌクレオポリン)の一つであるNup50と細胞質ダイニンの中間鎖CDIC2に注目し、これらが新規ERK基質かどうか検討した後、その生理的意義を明らかにすることを目的とした。GST融合タンパク質として精製したNup50もCDIC2も活性型ERK2によりin vitroで強くリン酸化されたため、ESI-IT型質量分析計を用いた解析とアラニン残基への点変異の導入によって各々のリン酸化部位を同定した。そして各々の部位に対する抗リン酸化抗体を作製することにより、Nup50とCDIC2が細胞内でERK活性化に依存してリン酸化されることを示した。Nup50はN末端ドメイン(importin-αと結合)、中央のFGリピートドメイン(importin-βと結合)、C末端のRan結合ドメインから構成されるが、ERKによるリン酸化部位はFGリピートドメインに集中していた。そこでimportin-βに対するpull-downアッセイを行ったところ、ERKでリン酸化されたNup50ではimportin-βとの結合が減弱することが判明した。従ってimportin-α/β依存的な核内輸送がERKによるヌクレオポリンのリン酸化で制御される可能性が示唆された。

報告書

(2件)
  • 2005 実績報告書
  • 2004 実績報告書
  • 研究成果

    (2件)

すべて 2004

すべて 雑誌論文 (2件)

  • [雑誌論文] Proteomic identification of Bcl2-associated athanogene 2 as a novel MAPK-activated protein kinase 2 substrate2004

    • 著者名/発表者名
      Ueda, K. et al.
    • 雑誌名

      J.Biol.Chem. 279(40)

      ページ: 41815-41821

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書
  • [雑誌論文] 2D DIGE技術を用いたリン酸化プロテオーム解析によるシグナル伝達経路構成因子の網羅的同定法2004

    • 著者名/発表者名
      小迫英尊, 牛山正人, 服部成介
    • 雑誌名

      実験医学 22(9)

      ページ: 1299-1304

    • 関連する報告書
      2004 実績報告書

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公開日: 2004-04-01   更新日: 2016-04-21  

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