微生物由来D-立体特異的ペプチダーゼと擬似基質を用いたペプチド合成に関する研究

• 研究課題/領域番号: 16780059
• 研究種目: 若手研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 応用微生物学
• 研究機関: 富山県立大学
• 研究代表者: 米田 英伸 富山県立大学, 工学部, 講師 (50285160)
• 研究期間 (年度): 2004 – 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 2,900千円 (直接経費: 2,900千円); 2005年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円); 2004年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
• キーワード: D-アミノ酸 / ペプチド合成 / ペプチダーゼ / Bacillus cereus

研究概要

Bacillus cereus DF4-B株由来のD-立体特異的ペプチダーゼ(アルカリD-ペプチダーゼ)はフェニルアラニンのオリゴペプチドをD-立体特異的に加水分解するエンドペプチダーゼであり、その一次構造は細菌由来のβ-ラクタマーゼやD-立体特異的アミノペプチダーゼと相同性を有するユニークな酵素である。本研究ではラセミ体アミノ酸アミドの光学分割やD-アミノ酸含有ペプチドの合成にしか利用されてこなかったD-立体特異的ペプチダーゼの新規利用法を開拓するため、Substrate mimeticsとよばれる擬似基質を用いたペプチド合成への本酵素の応用可能性を検討することを目的とした。前年度に引き続き、アルカリD-ペプチダーゼ及び、アルカリD-ペプチダーゼ相同タンパク質によるペプチド合成を検討した。ペプチド合成の収率や応用範囲に関してより優れた酵素を得るため、上記2種の酵素遺伝子にerror-prone PCR等の遺伝子操作によりランダム変異を導入し、ペプチド合成にかなう性質をもった変異酵素の取得を試みた。変異酵素を組換え大腸菌より精製し、酵素化学的な諸性質を明らかにして、野生型酵素と比較した。さらに、変異遺伝子の塩基配列を決定して、変異部位を同定し、その部位に対してその他のアミノ酸にランダムに変異を導入する、いわゆるサチュレーション変異を行い、酵素の性質がさらに向上した変異酵素の取得を試み、ペプチド合成への応用を検討した。

研究成果

• [雑誌論文] L-Stereoselective amino-acid amidase with broad substrate specificity from Brevundimonas diminuta : characterization of a new member of the leucine aminopeptidase family (2006)
  • 著者名/発表者名: Komeda, H., Hariyama, N., Asano Y.
  • 雑誌名: Appl.Microbiol.Biotechnol. 70 ページ: 412-421
• [雑誌論文] A DmpA-homologous protein from Pseudomonas sp. is a dipeptidase specific for β-alanyl dipeptides (2005)
  • 著者名/発表者名: Komeda, H, Asano, Y.
  • 雑誌名: FEBS J. 272 ページ: 3075-3084
• [雑誌論文] Asymmetric synthesis of L-α-methylcysteine with the amidase from Xanthobacter flavus NR303 (2005)
  • 著者名/発表者名: Inoue, A., Komeda, H, Asano, Y.
  • 雑誌名: Advanced Synthesis & Catalysis 347 ページ: 1132-1138
• [雑誌論文] Purification, characterization, gene cloning and nucleotide sequencing of D-stereospecific amino acid amidase from soil bacterium : Delftia acidovorans (2005)
  • 著者名/発表者名: Hongpattarakere, T., Komeda, H., Asano, Y
  • 雑誌名: J.Ind.Microbiol.Biotechnol. 32 ページ: 567-576
• [雑誌論文] S-Stereoselective piperazine-2-tert-butylcarboxamide hydrolase from Pseudomonas azotoformans IAM 1603 is a novel L-amino-acid amidase. (2004)
  • 著者名/発表者名: Komeda, H., Harada, H., Washika, S., Sakamoto, T., Ueda, M., Asano, Y.
  • 雑誌名: Eur.J.Biochem. 271 ページ: 1465-1475
• [雑誌論文] A novel R-stereoselective amidase from Pseudomonas sp. MCI3434 acting on piperazine-2-tert-butylcarboxamide. (2004)
  • 著者名/発表者名: Komeda, H., Harada, H., Washika, S., Sakamoto, T., Ueda, M., Asano, Y.
  • 雑誌名: Eur.J.Biochem. 271 ページ: 1580-1590
• [雑誌論文] Purification, characterization, gene cloning and nucleotide sequencing of D-stereospecific amino acid amidase from soil bacterium Delftia acidovorans
  • 著者名/発表者名: Hongpattarakere, T., Komeda, H., Asano, Y.
  • 雑誌名: J.Indust.Microbiol.Biotechnol. (in press)
• [雑誌論文] Asymmetric synthesis of L-α-methylcysteine with the amidase from Xanthobacter flavus NR303
  • 著者名/発表者名: Inone, A., Komeda, H., Asano, Y.
  • 雑誌名: Advanced Synthesis & Catalysis (in press)