| 研究概要 |
1.ラットミトコンドリアポーリンアイソザイム(VDAC1-3)をそれぞれ特異的に発現する酵母株を作製し,酵母ミトコンドリアにこれらポーリンアイゾザイムが機能的に発現していることを確認した。
2.昨年度確立した大腸菌発現系より精製したラットI型ヘキソキナーゼの各VDACアイゾザイムを発現した酵母ミトコンドリアに対する結合実験を行った.しかしながら,いかなるラットVDACが発現した酵母ミトコンドリアにもヘキソキナーゼは結合しなかった.VDACがヘキソキナーゼのミトコンドリア結合サイトであることは,過去の報告でも立証されているため,酵母ミトコンドリアに発現したVDACの存在状態や立体構造がラットミトコンドリア中のそれとは異なっていると考えられた.現在,VDACが酵母ミトコンドリアにおいて外膜に発現しているか,電子顕微鏡を用いて検討中である.
3.I型ヘキソキナーゼは活性制御ドメインであるN-halfと活性中心を含むC-halfの2つのドメインに別れ,これはリンカーとなるα-ヘリックスにより結ばれている.このα-ヘリックスを遺伝子工学的に延長した変異型ヘキソキナーゼでは,活性制御を引き起こすN-halfとC-halfの相互作用が解消されることを以前報告している.2.における大腸菌発現系で,この変異型を大量発現しようと試みたところ,野生型では可溶性画分に活性を保持して発現したのに対し,変異型は,封入体として発現した.この封入体をグアニジン変性させ,再フォールディングさせたが,タンパク質は再び凝集した.この結果から,分子間でのN-halfとC-halfの相互作用により,凝集体が生じたものと考えられ,より良い発現条件の検討を現在行っている.
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