| 研究概要 |
(1)NHBE肺癌発生モデルを用いたDNMT3b1/2とDNMT3b3の機能的差異の検討
NHB1Eに癌遺伝子であるテロメラーゼ,SV40ラージT抗原,H-rasを順次導入し,細胞を癌化させた.DNMT3bの各spliced formを個別に評価するために,RNA interference (RNAi)の原理を用いて,各spliced formにだけ含まれるシークエンスに対する2本鎖のRNAオリゴヌクレオチドを設計し,癌化したNHBEに対し,すべてのDNMT3b,DNMT3b1/3b2のみ,あるいはDNMT3b3のみを特異的にノックアウトした.特異的にノックアウトされたかどうかは,同様に各spliced formにだけ含まれるシークエンスから設計した,プライマーおよびプローブを用いて,定量的PCRにより確認した.その結果,各siRNA処理により,各spliced formが特異的に抑制されていることが確認された.各spliced formのノックアウトが確認されたこれらの細胞を用いて,コロニー形成能を比較し,癌化能への影響や,DNAメチル化との関連を検討した.コロニー形成能とDNAメチル化の検討により,相互の関連が示唆された.今後,各spliced formに対するRNAiで処理した癌化NHBEを用いて,標的遺伝子の検出を試みる.
(2)肺癌臨床検体を用いた検討
現在までにinformed consentが得られている数例の凍結標本に対して,microdissection法により,腫瘍部位および正常部位から検体を採取し,DNMT3bの発現を検討した.全DNMT3bに関しては腫瘍部位での発現に差が認められなかったのに対し,spliced formのうちDNMT3b3は腫瘍部位で正常に比し高発現していた.症例の集積とさらなる検証が必要である.
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