| 研究課題/領域番号 |
16790466
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
腎臓内科学
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
中山 裕史 熊本大学, 医学部附属病院, 助手 (00363531)
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| 研究期間 (年度) |
2004 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
2005年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
2004年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | V1a受容体 / V2受容体 / プロモーター活性 / 転写因子 / PKC |
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| 研究概要 |
まずPCRクローニングしたV1a受容体のcDNAを発現ベクターにサブクローニングし、このベクターを培養細胞(LLCPK1)にトランスフェクションした。ベクターの細胞へ導入にはFlip-Inシステムを用い、V1a受容体の恒常的な強制発現を検討した。細胞ではRT-PCR及びウェスタンブロット法にてV1a受容体が強発現していることが確認された。次にラットV2受容体のプロモーターをクローニングし、V1a受容体を強制発現させた培養細胞にトランスフェクションし、プロモーター活性を測定した。この検討でV1a受容体の発現がV2受容体のプロモーター活性を抑制することが判明した。培養細胞に実際にバゾプレッシンを作用させることでV2受容体の発現が制御されることも確認した。この作用はV1a受容体に特異的な拮抗薬にて抑制され、V2受容体の拮抗薬では抑制されず、V2受容体発現が抗利尿ホルモンのV1a受容体を介して直接制御されることが明らかとなった。またプロモーターベクターで30種類以上に及ぶdeletion seriesやmutationを作成し、V2受容体プロモーター活性制御において、V1a受容体による転写活性抑制の責任領域(consensus sequence)の解明を検討した。これにより転写領域の-600bp〜-50bpまでの塩基配列が責任領域であることが明らかとなった。
さらに、V1a受容体の情報伝達の下流にはPKCの活性化があり、この情報伝達経路がV2受容体発現を制御している可能性が考えられるため、PKC活性化薬(PMA)及び阻害薬(スタウロスポリン)のV2受容体のプロモーター活性への影響を検討した。V2受容体プロモーターをトランスフェクションした細胞にPMAを作用させるとV2受容体プロモーター活性は約50%に抑制され、さらにスタウロスポリンを追加投与すると、PMAによるプロモーター活性抑制が解除されることが認められた。これら薬剤によるプロモーター活性への作用は用量依存性であった。これらの結果よりV1a受容体及びPKC情報伝達系を介してV2受容体の発現が抑制されることが示唆された。またプロモーター活性の測定に用いる細胞としては、集合尿細管由来の培養細胞を用いるのが理想的であること、また培養細胞としてよりvivoに近い状態を得るため、マウスの腎臓からmicrodissection法を用いてネフロンセグメントを分離し、プライマリーカルチャーを行い、細胞系列の確立にも成功した。
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