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KRAS野生型大腸癌患者における抗EGFR抗体薬の二次的耐性の原因として、EGFR遺伝子の変異をはじめ、EGFR関連細胞内シグナル伝達経路の活性化などが報告されているが、臨床的に有用な抗EGFR抗体薬の二次的耐性予測マーカーは未だ確立されておらず、二次的耐性の回避方法についても十分には検討されていない。本申請課題では、質量分析計を用い、抗EGFR抗体薬耐性化前後の腫瘍細胞中のタンパク質を網羅的に解析し、それらタンパク質の細胞外への分泌量と二次的耐性との関連を評価することで、KRAS野生型大腸癌患者に対する抗EGFR抗体薬の二次的耐性予測に有用なマーカータンパク質の探索を行うこととした。
まず、抗EGFR抗体薬の1つであるセツキシマブに感受性のある2種類の大腸がん細胞株(C99、SW48)にセツキシマブを低濃度より曝露し、段階的に曝露濃度を上げることで後天的セツキシマブ耐性株を樹立した。セツキシマブ耐性化前後の細胞株の細胞内タンパク質を抽出し、還元アルキル化後、トリプシンにより断片化した。得られたサンプルを脱塩・濃縮カラムを用いて精製・濃縮し、LC-MS/MSにて解析をした。その結果、後天的セツキシマブ耐性株においてLDHB発現量の有意な上昇が認められた。また、ELISAによる検証でも、LC-MS/MSと同様に後天的セツキシマブ耐性株においてLDHBが有意に上昇していた。
本研究は抗体医薬品の耐性化予測としてLDHBが有用である可能性を示した最初の報告である。今後は、LDHB遺伝子のノックアウトを含む詳細な解析を行うことで、後天的耐性化におけるLDHBの役割を調査していく予定である。また、後天的セツキシマブ耐性株の培地中のLDHBの分泌量を調査することで、二次的耐性予測マーカーとしての有用性を調査する予定である。
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