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リグニン認識機能を賦与した人工酵素触媒の合成によるバイオマス分解新戦略

研究課題

研究課題/領域番号 16H02560
研究種目

基盤研究(A)

配分区分補助金
応募区分一般
研究分野 木質科学
研究機関京都大学

研究代表者

渡邊 隆司  京都大学, 生存圏研究所, 教授 (80201200)

研究分担者 入江 俊一  滋賀県立大学, 環境科学部, 准教授 (30336721)
磯崎 勝弘  京都大学, 化学研究所, 助教 (30455274)
西村 裕志  京都大学, 生存圏研究所, 助教 (50553989)
片平 正人  京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (70211844)
研究協力者 中村 正治  
高谷 光  
永田 崇  
研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
研究課題ステータス 完了 (2018年度)
配分額 *注記
40,040千円 (直接経費: 30,800千円、間接経費: 9,240千円)
2018年度: 14,820千円 (直接経費: 11,400千円、間接経費: 3,420千円)
2017年度: 14,820千円 (直接経費: 11,400千円、間接経費: 3,420千円)
2016年度: 10,400千円 (直接経費: 8,000千円、間接経費: 2,400千円)
キーワードリグニン / バイオマス / バイオリファイナリー / リグニン分解酵素 / 糖質結合モジュール / セルラーゼ / 金属ナノ粒子 / 酸化触媒 / 触媒 / 酵素 / 白色腐朽菌 / 酵素糖化 / ペプチド / ナノ触媒 / NMR / タンパク質
研究成果の概要

本研究では、リグニン親和性ポリペプチド鎖によるリグニン分解酵素の機能強化やマイクロ波増感ナノ粒子触媒の合成を研究した。リグニン親和性12merペプチドの二量体化により親和性が1桁上昇し、リグニンへの吸着によるペプチドのコンフォーメーション変化を明らかにした。糸状菌由来のセルラーゼの糖質結合モジュール(CBM)を安定同位体でラベルし、NMRによりリグニンとの結合サイトを初めて包括的に解析した。このCBMを担子菌ヒラタケの多機能型ペルオキシダーゼに結合した融合タンパクを発現する形質転換体を作出し、腐朽特性を解析した。また、リグニンモデルの酸化能をもつマイクロ波増感磁性金属ナノ粒子触媒を開発した。

研究成果の学術的意義や社会的意義

多糖を被覆するリグニンの高選択的分解は、木質バイオマス変換の鍵である。リグニン親和性ポリペプチド鎖をリグニン分解酵素や合成触媒に組み込む方法を開発し、その効果を明らかにすることにより、リグニン近傍へ酵素や人工触媒をデリバリーしてリグニンの分解性を高める分野が開拓される。融合酵素を白色腐朽菌で発現すると、リグニン分解強化株が育種される。また、リグニン親和性ペプチドをマイクロ波増感金属ナノ粒子触媒に結合させると、電磁波エネルギーの利用効率の高いリグニン分解触媒が合成される。本研究では、リグニン結合性ポリペプチド鎖を触媒の輸送ツールとして用いる新分野を創成し、バイオリファイナリーに貢献する。

報告書

(4件)
  • 2018 実績報告書   研究成果報告書 ( PDF )
  • 2017 実績報告書
  • 2016 実績報告書
  • 研究成果

    (52件)

すべて 2019 2018 2017 2016 その他

すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 6件、 オープンアクセス 5件) 学会発表 (40件) (うち国際学会 12件、 招待講演 11件) 図書 (1件) 備考 (5件)

  • [雑誌論文] NMR Analysis on Molecular Interaction of Lignin with Amino Acid Residues of Carbohydrate-Binding Module from Trichoderma reesei Cel7A2019

    • 著者名/発表者名
      Yuki Tokunaga, Takashi Nagata, Takashi Suetomi, Satoshi Oshiro, Keiko Kondo, Masato Katahira and Takashi Watanabe
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 9 号: 1 ページ: 1977-1977

    • DOI

      10.1038/s41598-018-38410-9

    • NAID

      120006554877

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Catalytic Performance of Food Additives Alum, Flocculating Agent, Al(SO4)3, AlCl3, and Other Lewis Acids in Microwave Solvolysis of Hardwoods and Recalcitrant Softwood for Biorefinery2018

    • 著者名/発表者名
      Yasunori Ohashi, Takashi Watanabe
    • 雑誌名

      ACS Omega

      巻: 3 号: 11 ページ: 16271-16280

    • DOI

      10.1021/acsomega.8b01454

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Robust Surface Plasmon Resonance Chips for Repetitive and Accurate Analysis of Lignin?Peptide Interactions2018

    • 著者名/発表者名
      Isozaki Katsuhiro、Shimoaka Takafumi、Oshiro Satoshi、Yamaguchi Asako、Pincella Francesca、Ueno Ryo、Hasegawa Takeshi、Watanabe Takashi、Takaya Hikaru、Nakamura Masaharu
    • 雑誌名

      ACS Omega

      巻: 3 号: 7 ページ: 7483-7493

    • DOI

      10.1021/acsomega.8b01161

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] High yield production of fungal manganese peroxidases by E. coli through soluble expression, and examination of the activities2018

    • 著者名/発表者名
      Lin Meng-I、Nagata Takashi、Katahira Masato
    • 雑誌名

      Protein Expr Purif

      巻: 145 ページ: 45-52

    • DOI

      10.1016/j.pep.2017.12.012

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Binding behaviour of a 12-mer peptide and its tandem dimer to gymnospermae and angiospermae lignins2017

    • 著者名/発表者名
      Oshiro, S., A. Yamaguchi, T. Watanabe
    • 雑誌名

      RSC Advances

      巻: 7 号: 50 ページ: 31338-31341

    • DOI

      10.1039/c7ra04807f

    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] A development and an improvement of selectable markers in Pleurotus ostreatus transformation.2017

    • 著者名/発表者名
      Matsunaga, Y., Ando, M., Izumitsu, K., Suzuki, K., Honda, Y., Irie, T.
    • 雑誌名

      Journal of Microbiological Methods

      巻: 134 ページ: 27-29

    • DOI

      10.1016/j.mimet.2017.01.007

    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 13Cラベル化リグニンオリゴマーモデルを用いたセルラーゼ糖質結合モジュールとの相互作用解析2019

    • 著者名/発表者名
      德永有希、永田崇、近藤敬子、片平正人、渡辺隆司
    • 学会等名
      第69回日本木材学会大会
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [学会発表] Magnetic iron oxide nanoparticles as green and recyclable catalysts for the selective microwave-assisted oxidation of secondary alcohols2019

    • 著者名/発表者名
      Francesca Pincella, Katsuhiro Isozaki, Hikaru Takaya, and Masaharu Nakamura
    • 学会等名
      IRCCS The 2nd International Symposium “New Future by Chemical Synthesis and Energy Materials”
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [学会発表] NMR法によるリグニン-セルラーゼ糖質結合モジュール間吸着の解析2018

    • 著者名/発表者名
      德永有希、永田崇、近藤敬子、片平正人、渡辺隆司
    • 学会等名
      第63回リグニン討論会
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [学会発表] Approaches for valorization of ligninocelluloses using microwave technology and lignin-binding catalysts2018

    • 著者名/発表者名
      Takashi Watanabe, Chen Qu, Satoshi Oshiro, Hiroshi Nishimura, Keiichiro Kashimura, Takashi Nagata, Masato Katahira, Katsuhiro Isozaki, Hikaru Takaya, Masaharu Nakamura
    • 学会等名
      Lignobiotech 2018, 5th Symposium of Biotechnology Applied to Lignocelluloses
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] 持続可能社会の構築に向けた植物バイオマスのマイクロ波変換プロセスの開発2018

    • 著者名/発表者名
      渡辺隆司
    • 学会等名
      マイクロウェーブ展 2018
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] リグニンファーストの植物バイオマス変換プロセスについて2018

    • 著者名/発表者名
      渡辺隆司
    • 学会等名
      高分子学会 第27回ポリマー材料フォーラム
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Design of conversion process for valorization of ligninocelluloses using microwave technology and catalysts2018

    • 著者名/発表者名
      Takashi Watanabe
    • 学会等名
      Xiamen Forum on Biomass Frontiers 2018
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] 電磁波触媒反応を利用したリグニン系化学品原料の生産2018

    • 著者名/発表者名
      渡辺隆司
    • 学会等名
      バイオマスエキスポ2018
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] マイクロ波触媒反応を用いた植物バイオマス変換2018

    • 著者名/発表者名
      渡辺隆司
    • 学会等名
      電磁波触媒反応を利用したリグニン系化学品原料の生産
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] リグニンファーストの植物バイオマス変換プロセスについて2018

    • 著者名/発表者名
      渡辺隆司
    • 学会等名
      JBA植物バイオ研究会 第13回会合「バイオマス生産と利活用」セミナー
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書 2017 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Trichoderma reesei由来Cel7AのCBM1がリグニンに吸着するメカニズムの解析2018

    • 著者名/発表者名
      德永有希、永田崇、近藤敬子、片平正人、渡辺隆司
    • 学会等名
      第32回セルラーゼ研究会
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Interaction analysis between cellulase carbohydrate-binding module and lignin by ultra-high sensitivity NMR for biorefinery2018

    • 著者名/発表者名
      Takashi Watanabe, Yuki Tokunaga, Satoshi Ohshiro, Hiroshi Nishimura, Takao Kishimoto, Masaharu Nakamura, Keiko Kondo, Takashi Nagata, Masato Katahira
    • 学会等名
      The 9th International Symposium of Advanced Energy Science -Frontier of Zero Emission Energy-
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] NMR化学シフト摂動法を用いたセルラーゼ糖質結合モジュールとリグニン間相互作用の解析2018

    • 著者名/発表者名
      德永有希、永田崇、近藤敬子、片平正人、渡辺隆司
    • 学会等名
      第385回生存圏シンポジウム(第15回持続的生存圏創成のためのエネルギー循環シンポジウムおよび第8回先進素材開発解析システム
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [学会発表] NMR analysis of non-productive binding of Carbohydrate Binding Module of Cellobiohydrolase with Lignin2018

    • 著者名/発表者名
      Yuki Tokunaga, Takashi Nagata, Keiko Kondo, Masato Katahira, Takashi Watanabe
    • 学会等名
      The 3rd Asia Research Node Symposium on Humanosphere Science
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Heterologous expression and characterization of enzymes of wood rotting fungi to be used for utilization of woody biomass2018

    • 著者名/発表者名
      Masato Katahira
    • 学会等名
      The 9th International Symposium of Advanced Energy Science -Frontier of Zero Emission Energy-
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Microwave-assisted oxidation of secondary alcohols with magnetic nanoparticle catalysts2018

    • 著者名/発表者名
      Francesca Pincella, Katsuhiro Isozaki, Hikaru Takaya, Masaharu Nakamura
    • 学会等名
      日本化学会第98春季年会
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [学会発表] nteraction analysis between cellulase carbohydrate-binding module and lignin by ultra-high sensitivity NMR for biorefinery2018

    • 著者名/発表者名
      10.Takashi Watanabe, Yuki Tokunaga, Satoshi Ohshiro, Hiroshi Nishimura, Takao Kishimoto, Masaharu Nakamura, Keiko Kondo, Takashi Nagata, Masato Katahira
    • 学会等名
      The 9th International Symposium of Advanced Energy Science -Frontier of Zero Emission Energy-
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] セルラーゼ糖質結合モジュールとリグニン間相互作用部位のNMRによる解析2018

    • 著者名/発表者名
      德永有希、大城理志、永田崇、近藤敬子、片平正人、渡辺隆司
    • 学会等名
      第68回日本木材学会大会
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
  • [学会発表] マイクロ波反応を利用したリグノセルロース系バイオマスのバイオ燃料・化学品への変換2018

    • 著者名/発表者名
      渡辺隆司
    • 学会等名
      第11回日本電磁波エネルギー学会シンポジウム
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 安定同位体標識法を用いたセルラーゼ糖質結合モジュールとリグニン間相互作用のNMRによる解析2017

    • 著者名/発表者名
      德永有希、大城理志、近藤敬子、永田崇、西村裕志、片平正人、渡辺隆司
    • 学会等名
      第67回日本木材学会大会
    • 発表場所
      福岡
    • 年月日
      2017-03-17
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
  • [学会発表] タンデムダイマー化によるリグニン親和性ペプチドの親和性強化とリグニン認識におけるペプチドの構造変化の解析2017

    • 著者名/発表者名
      大城理志、山口亜佐子、渡辺隆司
    • 学会等名
      第67回日本木材学会大会
    • 発表場所
      福岡
    • 年月日
      2017-03-17
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
  • [学会発表] Analysis of Peptide-Lignin Binding using Surface Plasmon Resonance for Lignocellulosic Biorefinery2017

    • 著者名/発表者名
      Satoshi Oshiro, Asako Yamaguchi, Katsuhiro Isozaki, Masaharu Nakamura, Hikaru Takaya and Takashi Watanabe
    • 学会等名
      Institute for Chemical Research International Symposium 2016 (ICRIS'16)
    • 発表場所
      宇治
    • 年月日
      2017-03-07
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Design of catalytic conversion process for production of biofuels and chemicals from lignocellulosic biomass2017

    • 著者名/発表者名
      Takashi Watanabe
    • 学会等名
      The 2nd Asia Research Node Symposium on Humanosphere Science
    • 発表場所
      ペナン
    • 年月日
      2017-02-20
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Analysis of Interaction Between Carbohydrate Binding Module of Cellulase and Lignin2017

    • 著者名/発表者名
      Yuki Tokunaga, Satoshi Oshiro, Keiko Kondo, Takashi Nagata, Hiroshi Nishimura, Masato Katahira, Takashi Watanabe
    • 学会等名
      Asia Research Node Symposium on Humanosphere Science
    • 発表場所
      ペナン
    • 年月日
      2017-02-20
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] Binding analysis between the tandem dimer of 12-mer peptide and lignin2017

    • 著者名/発表者名
      Satoshi Oshiro, Asako Yamaguchi, Takashi Watanabe
    • 学会等名
      Asia Research Node Symposium on Humanosphere Science
    • 発表場所
      ペナン
    • 年月日
      2017-02-20
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 国際学会
  • [学会発表] マイクロ波触媒反応を介した植物からのリグニン系機能性ポリマーの創成2017

    • 著者名/発表者名
      渡辺隆司
    • 学会等名
      バイオマスエキスポ 2017 Tokyo
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] Designing of synergistic enzyme systems for biomass saccharification2017

    • 著者名/発表者名
      Benjarat Bunterngsook, Pattanop Kanokratana, Satoshi Oshiro, Takashi Watanabe, Verawat Champreda
    • 学会等名
      The 2nd Asia Research Node Symposium on Humanosphere Science
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
  • [学会発表] Lignin-binding behavior of tandem dimer of 12-mer peptide and its potential as a novel lignin-binding molecular tool2017

    • 著者名/発表者名
      Satoshi Oshiro, Asako Yamaguchi and Takashi Watanabe
    • 学会等名
      The 2nd Asia Research Node Symposium on Humanosphere Science
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
  • [学会発表] NMR analysis of interaction mechanism between carbohydrate binding module of cellulase and lignin2017

    • 著者名/発表者名
      Yuki Tokunaga, Satoshi Oshiro, Keiko Kondo, Takashi Nagata, Hiroshi Nishimura, Masato Katahira, Takashi Watanabe
    • 学会等名
      The 2nd Asia Research Node Symposium on Humanosphere Science
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
  • [学会発表] リグニン固定化自己組織化単分子膜を利用したSPRセンサーの開発2017

    • 著者名/発表者名
      磯﨑勝弘,下赤卓史,大城理志,山口亜佐子,ピンチェラ フランチェスカ,上野 亮,長谷川 健,渡辺隆司,高谷 光,中村正治
    • 学会等名
      ナノ学会第15回大会
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
  • [学会発表] タンデムダイマー化したリグニン親和性ペプチドの結合解析とペプチド配列を担持した酵素によるリグニン分解2017

    • 著者名/発表者名
      大城 理志、山口 亜佐子、渡辺 隆司
    • 学会等名
      第62回リグニン討論会
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
  • [学会発表] NMR法によるセルラーゼ糖質結合モジュール-リグニン間相互作用の解2017

    • 著者名/発表者名
      德永有希、大城理志、永田崇、近藤敬子、西村裕志、片平正人、渡辺隆司
    • 学会等名
      第31回セルラーゼ研究会
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
  • [学会発表] ONO-Pincer Ruthenium-Complex-Bound Norvaline-Catalyzed Oxidation Reactions2017

    • 著者名/発表者名
      Takafumi Shanoh, Ryota Yoshida, Tomoya Yokoi, Katsuhiro Isozaki, Hiroshi Nishimura, Satoshi Ohshiro, Keiko Kondo, Takashi Watanabe, Masato Katahira, Hikaru Takaya, Masaharu Nakamura
    • 学会等名
      International Conference on Coordination Chemistry, 2018
    • 関連する報告書
      2017 実績報告書
  • [学会発表] タンデムダイマー化した12-merリグニン親和性ペプチドとリグニンの相互作用解析2017

    • 著者名/発表者名
      大城理志、山口亜佐子、渡辺隆司
    • 学会等名
      第13回持続的生存圏創成のためのエネルギー循環シンポジウム ―マイクロ波高度利用と先端分析化学―、第6回先進素材開発解析システム(ADAM)シンポジウム
    • 発表場所
      宇治
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
  • [学会発表] セルラーゼ糖質結合モジュールとリグニン間相互作用の解析2017

    • 著者名/発表者名
      德永有希、大城理志、末冨高志、近藤敬子、永田崇、西村裕志、片平正人、渡辺隆司
    • 学会等名
      第13回持続的生存圏創成のためのエネルギー循環シンポジウム ―マイクロ波高度利用と先端分析化学―、第6回先進素材開発解析システム(ADAM)シンポジウム
    • 発表場所
      宇治
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
  • [学会発表] Design of catalytic conversion process for production of biofuels and chemicals from lignocellulosic biomass2016

    • 著者名/発表者名
      Takashi Watanabe
    • 学会等名
      The 28th annual meeting of Thai Society for Biotechnology and international conference, Natural Resources & Bio-based innovative products
    • 発表場所
      チェンマイ
    • 年月日
      2016-11-28
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] リグノセルロースバイオリファイナリーのためのリグニン・ペプチド間相互作用解析2016

    • 著者名/発表者名
      山口亜佐子、末富高志、大城理志、徳永有希、西村裕志、永田崇、真嶋司、 片平正人、磯﨑勝弘、高谷光、中村正治、渡辺隆司
    • 学会等名
      第61回リグニン討論会
    • 発表場所
      宇治
    • 年月日
      2016-10-27
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
  • [学会発表] リグノセルロース系バイオマスからのバイオ燃料・機能化学品生産のための成分分離のデザイン2016

    • 著者名/発表者名
      渡辺隆司
    • 学会等名
      第46回石油・石油化学討論会
    • 発表場所
      京都
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 招待講演
  • [学会発表] 持続的社会の構築を目指したバイオマスのバイオ燃料・機能性物質への変換2016

    • 著者名/発表者名
      渡辺隆司
    • 学会等名
      第21回京都大学宇治キャンパス産学交流会
    • 発表場所
      宇治
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
  • [学会発表] Analysis of molecular interaction of peptides with lignin for lignocellulosic biorefinery2016

    • 著者名/発表者名
      T. Watanabe, A. Yamaguchi, S. Oshiro, T. Suetomi, H. Nishimura, T. Nagata, T. Mashima, M. Katahira, K. Isozaki, H. Takaya, M. Nakamura
    • 学会等名
      LignoBiotech IV - 4th Symposium on Biotechnology applied to Lignocelluloses
    • 発表場所
      マドリッド
    • 関連する報告書
      2016 実績報告書
    • 国際学会
  • [図書] Bioethanol From Sugarcane Bagasse: Status and Perspectives, in “Bioethanol Production from Food Crops 1st Edition Sustainable Sources, Interventions, and Challenges”2018

    • 著者名/発表者名
      Sadat M.R. Khattab and Takashi Watanabe
    • 総ページ数
      460
    • 出版者
      Academic Press
    • ISBN
      9780128137666
    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [備考] セルラーゼとリグニンの相互作用をはじめて分子レベルで包括的に解明 ―バイオマス変換や酵素科学に貢献―

    • URL

      http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/research/research_results/2018/190213_1.html

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [備考] 京都大学、セルラーゼとリグニンの相互作用をはじめて分子レベルで包括的に解明

    • URL

      https://bio.nikkeibp.co.jp/atcl/release/19/02/15/06842/

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [備考] セルラーゼとリグニンの相互作用をはじめて分子レベルで包括的に解明 -バイオマス変換や酵素科学に貢献-

    • URL

      http://www.rish.kyoto-u.ac.jp/news/pressrelease20190214/

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [備考] セルラーゼとリグニンの相互作用をはじめて分子レベルで包括的に解明 -バイオマス変換や酵素科学に貢献-

    • URL

      http://www.iae.kyoto-u.ac.jp/zero_emission/information/2019/02/14-092319.html

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書
  • [備考] セルラーゼとリグニンの相互作用をはじめて分子レベルで包括的に解明 -バイオマス変換や酵素科学に貢献-

    • URL

      https://research-er.jp/articles/view/77336

    • 関連する報告書
      2018 実績報告書

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公開日: 2016-04-21   更新日: 2020-03-30  

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