進化工学と有機合成の融合による革新的蛍光プローブの開発

• 研究課題/領域番号: 16J01710
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 国内
• 研究分野: ケミカルバイオロジー
• 研究機関: 埼玉大学
• 研究代表者: 寺井 琢也 埼玉大学, 理工学研究科, 特別研究員(SPD) (00508145)
• 研究期間 (年度): 2016-04-22 – 2019-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2018年度)
• 配分額: 11,700千円 (直接経費: 9,000千円、間接経費: 2,700千円); 2018年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円); 2017年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円); 2016年度: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)
• キーワード: 進化分子工学 / ペプチド化学 / 蛍光センサー / 合成化学

研究実績の概要

前年度までに確立したcDNA display技術を活用して、引き続き蛍光修飾ペプチドライブラリを使った「標的タンパク質に結合することで発光特性が変わる蛍光プローブ」および「プロテアーゼに対する特異的発蛍光基質」の開発を行った。
前者に関しては、各候補ペプチド配列の「蛍光変化」を直接検出可能なフローサイトメーター（FACS）評価系を利用した2段階セレクションシステムを立ち上げるため、ペプチドライブラリをコードするＤＮＡを酵母発現用のプラスミドに導入し、酵母表面に候補ペプチドを発現させて蛍光修飾した。続いてFACSで個別の蛍光を測定・分取することによりセレクションを行った。しかし、細胞表面の内在性タンパク質の影響が予想より大きくＳ／Ｎの良いセレクションを実施する事は出来なかった。そこでマイクロビーズ表面にＤＮＡとペプチドを修飾する新たな系を構築することを試みた。種々の条件検討の結果、２種類のモデルＤＮＡを別々のビーズ上に結合させ、夫々に対応するペプチドを当該ビーズ上に固定して分取することに成功した。
また後者においては、プロテアーゼによって切断を受けたペプチド配列をセレクションするシステムの構築に前年度の研究で概ね成功している。そこで今年度は更に条件検討を進め、実際にランダムライブラリからの基質セレクションを行った。その結果、セリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼに対して効率よく酵素反応を受けるペプチド配列を濃縮し、次世代シークエンス解析によって基質配列に関する知見を得ることができた。

現在までの達成度 (段落)

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] キュリー研究所/CNRS(フランス)
• [雑誌論文] Selection of peptides that associate with dye-conjugated solid surfaces in a pH-dependent manner using cDNA display (2019)
  • 著者名/発表者名: Takuya Terai, Hiroki Anzai, and Naoto Nemoto
  • 雑誌名: ACS Omega 巻: 4 号: 4 ページ: 7378-7384
  • DOI: 10.1021/acsomega.9b00631
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Synthesis of unsymmetrical Si-rhodamine fluorophores and application to a far-red to near-infrared fluorescence probe for hypoxia (2018)
  • 著者名/発表者名: Hanaoka Kenjiro、Kagami Yu、Piao Wen、Myochin Takuya、Numasawa Koji、Kuriki Yugo、Ikeno Takayuki、Ueno Tasuku、Komatsu Toru、Terai Takuya、Nagano Tetsuo、Urano Yasuteru
  • 雑誌名: Chemical Communications 巻: 54 号: 50 ページ: 6939-6942
  • DOI: 10.1039/c8cc02451k
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of a Series of Practical Fluorescent Chemical Tools to Measure pH Values in Living Samples (2018)
  • 著者名/発表者名: Takahashi Shodai、Kagami Yu、Hanaoka Kenjiro、Terai Takuya、Komatsu Toru、Ueno Tasuku、Uchiyama Masanobu、Koyama-Honda Ikuko、Mizushima Noboru、Taguchi Tomohiko、Arai Hiroyuki、Nagano Tetsuo、Urano Yasuteru
  • 雑誌名: Journal of the American Chemical Society 巻: 140 号: 18 ページ: 5925
  • DOI: 10.1021/jacs.8b00277
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Study to Select pH-dependent Phenolphthalein-Binding Peptide Aptamers by cDNA Display Method (2018)
  • 著者名/発表者名: Hiroki Anzai, Takuya Terai, and Naoto Nemoto
  • 雑誌名: Peptide Science 巻: 2017 ページ: 54-55
  • 査読あり
• [雑誌論文] A protein-coupled fluorescent probe for organelle-specific imaging of Na+ (2018)
  • 著者名/発表者名: Ryo Taguchi, Takuya Terai, Tasuku Ueno, Toru Komatsu, Kenjiro Hanaoka, and Yasuteru Urano
  • 雑誌名: Sensor Actuat. B－Chem. 巻: 265 ページ: 575-581
  • DOI: 10.1016/j.snb.2018.03.090
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of an Azo-Based Photosensitizer Activated under Mild Hypoxia for Photodynamic Therapy (2017)
  • 著者名/発表者名: Piao Wen、Hanaoka Kenjiro、Fujisawa Tomotsumi、Takeuchi Satoshi、Komatsu Toru、Ueno Tasuku、Terai Takuya、Tahara Tahei、Nagano Tetsuo、Urano Yasuteru
  • 雑誌名: J. Am. Chem. Soc. 巻: 139 号: 39 ページ: 13713-13719
  • DOI: 10.1021/jacs.7b05019
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Synthesis of Practical Red Fluorescent Probe for Cytoplasmic Calcium Ions with Greatly Improved Cell-membrane Permeability (2017)
  • 著者名/発表者名: Kazuhisa Hirabayashi, Kenjiro Hanaoka, Takahiro Egawa, Chiaki Kobayashi, Shodai Takahashi, Toru Komatsu, Tasuku Ueno, Takuya Terai, Yuji Ikegaya, Tetsuo Nagano, Yasuteru Urano
  • 雑誌名: Data in Brief 巻: 12 ページ: 351-357
  • DOI: 10.1016/j.dib.2017.04.011
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] In vitro Selection of Random Peptides against Artificial Lipid Bilayers: A Potential Tool to Immobilize Molecules on Membranes (2017)
  • 著者名/発表者名: Shota Kobayashi, Takuya Terai, Yuki Yoshikawa, Ryoya Ohkawa, Mika Ebihara, Masahito Hayashi, Kingo Takiguchi, and Naoto Nemoto
  • 雑誌名: Chem Commun (Camb) 巻: 53 号: 24 ページ: 3458-3461
  • DOI: 10.1039/c7cc00099e
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Enhanced mRNA-protein fusion efficiency of a single-domain antibody by selection of mRNA display with additional random sequences in the terminal translated regions (2017)
  • 著者名/発表者名: Kazuki Takahashi, Masato Sunohara, Takuya Terai, Shigefumi Kumachi and Naoto Nemoto
  • 雑誌名: Biophysics and Physicobiology 巻: 14 号: 0 ページ: 23-28
  • DOI: 10.2142/biophysico.14.0_23
  • NAID: 130005396150
  • ISSN: 2189-4779
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Improving The Solubility of Artificial Ligands of Streptavidin to Enable More Practical Reversible Switching of Protein Localization in Cells (2017)
  • 著者名/発表者名: Ryo Tachibana, Takuya Terai, Gaelle Boncompain, Shigeru Sugiyama, Nae Saito, Franck Perez and Yasuteru Urano
  • 雑誌名: ChemBioChem 巻: 18 号: 4 ページ: 358-362
  • DOI: 10.1002/cbic.201600640
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] cDNA display法を用いた夾雑環境下での試験管内淘汰 (2019)
  • 著者名/発表者名: 安齋 宏紀、根本 直人、寺井 琢也
  • 学会等名: 日本化学会第99春季年会
• [学会発表] In vitro selection of peptide aptamers that recognize a specific conformation of an organic dye (2019)
  • 著者名/発表者名: 寺井 琢也、安齋 宏紀、山田 陸、根本 直人
  • 学会等名: 日本化学会第99春季年会
• [学会発表] 進化分子工学による低分子認識ポリペプチドの開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 寺井 琢也、安齋 宏紀、山田 陸、根本 直人
  • 学会等名: Future Trend in Polymer Science 2018
• [学会発表] pH応答型タンパク質精製システムを目指した低分子結合ペプチドの探索研究 (2018)
  • 著者名/発表者名: 山田 陸、安齋 宏紀、寺井 琢也、根本 直人
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] cDNA display法を用いたプロテアーゼの基質探査法の開発 (2018)
  • 著者名/発表者名: 藤谷 聡、寺井 琢也、根本 直人
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] Development of Phenolphthalein Binding Peptide Aptamers Using cDNA Display (2018)
  • 著者名/発表者名: Hiroki Anzai, Riku Yamada, Takuya Terai, Naoto Nemoto
  • 学会等名: 10th International Peptide Symposium
  • 国際学会
• [学会発表] cDNA display法によるペプチドスクリーニングの最前線 (2017)
  • 著者名/発表者名: 寺井琢也、安齋宏紀、小林省太、吉川祐紀、蛯原三華、根本 直人
  • 学会等名: 日本化学工学会 第49回秋季大会
• [学会発表] 進化分子工学を用いた有機小分子の構造変化を認識するペプチドアプタマーの開発 (2017)
  • 著者名/発表者名: 安齋宏紀、寺井琢也、根本直人
  • 学会等名: 第11回バイオ関連化学シンポジウム
• [学会発表] Phenolphthalein binding peptide aptamers by in vitro selection using complementary DNA display (2017)
  • 著者名/発表者名: 安齋宏紀、寺井琢也、根本直人
  • 学会等名: 第54回ペプチド討論会
• [学会発表] 合成繊維（ナイロン）を分解する人工ペプチド酵素の創生 (2016)
  • 著者名/発表者名: 照井直樹、寺井琢也、根本直人
  • 学会等名: 日本分子生物学会第39回年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2016-11-30
• [学会発表] ゲルシフトセレクションによるシングルドメイン抗体（VHH）のmRNA-タンパク質複合体形成効率の向上 (2016)
  • 著者名/発表者名: 春原聖人、高橋一貴、寺井琢也、熊地重文、根本直人
  • 学会等名: 日本分子生物学会第39回年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2016-11-30
• [学会発表] リポソーム結合ペプチド LB-1を用いた脂質二重膜表面へのタンパク質提示手法の開発 (2016)
  • 著者名/発表者名: 寺井琢也、蛯原三華、大川僚也、小林省太、吉川祐紀、根本直人
  • 学会等名: 日本分子生物学会第39回年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2016-11-30
• [学会発表] 構造解析に基づく新規streptavidin結合分子の開発 (2016)
  • 著者名/発表者名: 藤掛椋、寺井琢也、杉山成、浦野泰照
  • 学会等名: 第１６回東京大学生命科学シンポジウム
  • 発表場所: 東京大学（東京都目黒区）
• [図書] ペプチド医薬品のスクリーニング・安定化・製剤化技術 (2017)
  • 著者名/発表者名: 寺井琢也、熊地重文、根本直人
  • 総ページ数: 557
  • 出版者: 技術情報協会
• [備考] 埼玉大学工学部応用化学科根本研究室ホームページ
  • URL: http://park.saitama-u.ac.jp/~nemoto/
• [備考] 東京大学薬学部薬品代謝化学教室ホームページ
  • URL: http://www.f.u-tokyo.ac.jp/~taisha/
• [備考] 埼玉大学工学部機能材料工学科根本研究室ホームページ
  • URL: http://park.saitama-u.ac.jp/~nemoto/
• [産業財産権] 分子精製用リガンド、分子精製用タグペプチド及びこれらを用いた分子精製方法 (2018)
  • 発明者名: 根本直人、寺井琢也、安齋宏紀、山田陸
  • 権利者名: 埼玉大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2018-162831
  • 出願年月日: 2018
• [産業財産権] 分子精製用リガンド、分子精製用タグペプチド及びこれらを用いた分子精製方法 (2017)
  • 発明者名: 安齋宏紀、寺井琢也、根本直人
  • 権利者名: (株)Epsilon Molecular Engineering
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2017-167056
  • 出願年月日: 2017