修復エラーを介したゲノム編集時に引き起こされる麹菌の大規模欠失機構の解明

• 研究課題/領域番号: 16K07706
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用生物化学
• 研究機関: 琉球大学 (2017-2018); 独立行政法人酒類総合研究所 (2016)
• 研究代表者: 水谷 治 琉球大学, 農学部, 准教授 (10443996)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2018年度)
• 配分額: 4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円); 2018年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2017年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円); 2016年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: ゲノム編集 / 黄麹菌 / TALEN / CRISPR/Cas9 / 大規模欠失 / DNA 切断修復 / ligD / 麹菌 / 人工ヌクレアーゼ (TALENs) / DNA 二本鎖切断修復 / 人工ヌクレアーゼ (TALEN) / DNA 修復 / 遺伝子工学 / ゲノム修復 / 育種

研究成果の概要

麹菌野生株において、TALENs を用いて非相同末端結合 (NHEJ) 修復エラー介したゲノム編集を行うと、得られたゲノム編集株の約半分程度で 1 kb 以上もの大規模欠失が観察された。また、CRISPR/Cas9 を用いて同様にゲノム編集を麹菌野生株に対して行っても、大規模欠失が観察されたことから、ゲノム編集ツールの切断様式に、大規模欠失が依存していないことが示唆された。また、NHEJの末端結合に必要な ligase をコードする ligD 遺伝子破壊株を用いて、ゲノム編集を行ったところ、野生株で観察された大規模欠失が、ligD 破壊株では部分的に抑制されていた。

研究成果の学術的意義や社会的意義

本研究は、麹菌の新規育種を目指して、ゲノム編集ツールの一つである TALEN を用いた非相同末端結合修復エラーによるゲノム編集を行ったところ、酵母や高等動植物で見られるような数 bp の欠失の他に 1 kb 以上もの大規模な欠失が観察されたことに端を発している。本研究成果により、従来、他の生物と同様と考えられていた麹菌の DNA ２本鎖切断修復機構において、麹菌独自の機構が存在する可能性が示唆され、このメカニズムの解明により新規な麹菌育種法の開発等に繋がると期待される。

研究成果

• [雑誌論文] Influence of α-1,3-glucan synthase gene agsE on protoplast formation for transformation of Aspergillus luchuensis (2019)
  • 著者名/発表者名: Tokashiki Jikian、Hayashi Risa、Yano Shigekazu、Watanabe Taisuke、Yamada Osamu、Toyama Hirohide、Mizutani Osamu
  • 雑誌名: Journal of Bioscience and Bioengineering 巻: 印刷中 号: 2 ページ: 129-134
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2019.01.018
  • NAID: 40021976308
  • 査読あり
• [雑誌論文] Self-excising Cre/mutant lox marker recycling system for multiple gene integrations and consecutive gene deletions in Aspergillus oryzae (2017)
  • 著者名/発表者名: Zhang Silai、Ban Akihiko、Ebara Naoki、Mizutani Osamu、Tanaka Mizuki、Shintani Takahiro、Gomi Katsuya
  • 雑誌名: Journal of Bioscience and Bioengineering 巻: 123 号: 4 ページ: 403-411
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2016.11.001
  • NAID: 40021178785
• [雑誌論文] Detailed analysis of targeted gene mutations caused by the Platinum-Fungal TALENs in Aspergillus oryzae RIB40 strain and a ligD disruptant (2017)
  • 著者名/発表者名: Mizutani, O., Arazoe, T., Toshida, K., Hayashi, R., Ohsato, S., Skuma, T., Yamamoto, T., Kuwata, S. and Yamada, O.
  • 雑誌名: Journal of Biotechnology and Bioengineering 巻: 3 号: 3 ページ: 287-293
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2016.09.014
  • NAID: 40021152739
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cellular responses to the expression of unstable secretory proteins in the filamentous fungus Aspergillus oryzae (2017)
  • 著者名/発表者名: Jun-ichi Yokota, Daisuke Shiro, Mizuki Tanaka, Yasumichi Onozaki, Osamu Mizutani, Dararat Kakizono, Sakurako Ichinose, Tomoko Shintani, Katsuya Gomi, Takahiro Shintani
  • 雑誌名: Appl. Microbiol. Biotechnol. 巻: 101(6) 号: 6 ページ: 2437-2446
  • DOI: 10.1007/s00253-016-8086-3
  • 査読あり
• [学会発表] 麹菌 ligD 遺伝子がゲノム編集に起因する大規模欠失変異に与える影響 (2018)
  • 著者名/発表者名: 上元 優, 林 梨咲, 渡嘉敷直杏, 荒添貴之, 山田 修, 外山博英, 水谷 治
  • 学会等名: 第３回ゲノム編集学会
• [学会発表] ゲノム編集時に引き起こされる麹菌 Aspergillus oryzae の大規模欠失機構に関する研究 (2018)
  • 著者名/発表者名: 水谷 治, 林 梨咲, 渡嘉敷直杏, 上里優希, 上元 優, 玉井萌子, 荒添貴之, 山田 修, 外山博英
  • 学会等名: 日本農芸化学会 2018 年度大会
• [学会発表] 麹菌における TALENs と CRISPR/Cas9 の違いによる大規模欠失変異の比較 (2017)
  • 著者名/発表者名: 水谷 治, 利田賢次, 林梨咲, 渡嘉敷直杏, 荒添貴之, 西田敬二, 和田悠作, 織田健, 岩下和裕, 山田 修, 外山博英
  • 学会等名: 第 2 回ゲノム編集学会
• [学会発表] 麹菌における Cre-loxP システムの利用と TALEN を用 いたゲノム編集 (2017)
  • 著者名/発表者名: 水谷 治, 山田 修, 家藤治幸
  • 学会等名: 第 69 回日本生物工学会大会
• [学会発表] 非相同末端結合に関与する遺伝子破壊株における麹菌の TALENs を用いたゲノム編集 (2016)
  • 著者名/発表者名: 水谷 治, 荒添貴之, 利田賢次, 林梨咲, 大里修一, 佐久間哲史, 山本 卓, 桑田茂, 山田 修
  • 学会等名: 第 68 回日本生物工学会大会
  • 発表場所: 富山
  • 年月日: 2016-09-28
• [学会発表] 麹菌野生株及び ligD 遺伝子破壊株を宿主とした Platinum-Fungal TALENs を用いたゲノム編集 (2016)
  • 著者名/発表者名: 水谷 治, 荒添貴之, 利田賢次, 林梨咲, 大里修一, 佐久間哲史, 山本 卓, 桑田茂, 山田 修
  • 学会等名: 日本ゲノム編集学会第１回大会
  • 発表場所: 広島
  • 年月日: 2016-09-06