| 研究課題/領域番号 |
16K08265
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
薬理系薬学
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| 研究機関 | 熊本大学 (2018)
岐阜薬科大学 (2016-2017) |
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研究代表者 |
塩田 倫史 熊本大学, 発生医学研究所, 准教授 (00374950)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2018年度)
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| 配分額 *注記 |
4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2018年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2017年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2016年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | グアニン四重鎖 / 神経細胞 / 神経変性疾患 / RNA-G4 構造/タンパク質複合体 / 遺伝性神経変性疾患 / 神経疾患 / DNA / RNA / RAN translation |
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| 研究実績の概要 |
これまで、グアニン四重鎖構造認識単鎖可変領域フラグメント (BG4-scFv) を用いて生細胞のグアニン四重鎖構造の可視化に成功した。このグアニン四重鎖認識 scFv に FLAG タグを付加し哺乳類発現プラスミドでマウス神経芽細胞腫 Neuro-2a に発現させたところ、細胞核内に DNA 上のグアニン四重鎖として微小な粒子が観察され、さらに細胞質には RNA グアニン四重鎖構造/蛋白質複合体である比較的大きな顆粒が観察された。これらは、 DNase や RNase 処置によりそれぞれ消失することを確認できた。また、グアニン四重鎖構造の細胞内動態を生細胞観察するために EGFP を付加したが、構造変化が起こりグアニン四重鎖構造を正確に認識することができなかった。そのため、6 残基のアミノ酸 Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys 配列のテトラシステイン（TC）モチーフを挿入し、TC モチーフと結合し緑色蛍光を発する FlAsH を用いたところ、生細胞のグアニン四重鎖構造可視化に成功した。さらに、BG4-scFv によるマウス脳組織由来免疫沈降物に対して次世代 RNA シーケンサーと LC-MS/MS ショットガン解析を行い、マウス脳内のグアニン四重鎖構造/蛋白質複合体の構成成分を同定した。それら複合体には、これまでに報告がない新規グアニン四重鎖形成 mRNA 及び結合蛋白質が数種含まれていた。BG4-scFv を用いることで、グアニン四重鎖の細胞内局在や構成成分を明らかにできた。
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