| 研究課題/領域番号 |
16K11510
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
病態科学系歯学・歯科放射線学
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
西下 一久 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (20237697)
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| 研究分担者 |
筑波 隆幸 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (30264055)
岡元 邦彰 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (10311846)
坂井 詠子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (10176612)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2018-03-31
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| 研究課題ステータス |
中途終了 (2017年度)
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| 配分額 *注記 |
4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円)
2018年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2017年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2016年度: 2,730千円 (直接経費: 2,100千円、間接経費: 630千円)
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| キーワード | 破骨細胞 / リソソーム分泌 / Rab27a / RAW264.7 / ネオマイシン / 恒常発現細胞クローン / 骨吸収 / Rabタンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
１）マクロファージ及び破骨細胞Rab27A結合タンパク質の同定
Rabタンパク質は通常、種々のエフェクタータンパク質と相互作用して働く。そのために結合タンパク質の同定は、rabタンパク質を理解するうえで必要不可欠である。さらに破骨細胞では、リソソームを分泌するという特徴があるにもかかわらず、破骨細胞におけるRab結合タンパク質はこれまで同定されていない。そこでマクロファージ及び破骨細胞におけるRab27A結合タンパク質を同定する方法として以下の方法を試みた。
①酵母ツーハイブリッドシステムを用いて相互作用する分子を分子生物学的に同定する方法。この方法は２つの対象タンパク質間の直接相互作用を試験するための、高感度な方法である。相互作用パートナーは、その後選択された酵母コロニーで対応するプラスミドをシークエンシングすることによって得ることができる。しかしこの方法では同定できなかった。
②Rab27A過剰発現細胞を用いて、Rab27Aプルダウンアッセイを行い、結合タンパク質をプロテオーム解析により同定する方法。恒常的に活性型であるドミナント・アクティブ型、恒常的に不活性型であるドミナント・ネガティブ型を発現させて、結合タンパク質の違いがあるかどうかを解析した。
③結合タンパク質がRab27Aのどの部位に結合するかを調べるために、部位特異的遺伝子変異体を用いて結合部位の同定を試みた。さらにこの実験系を用いて、結合するタンパク質を免疫沈降やプロテオーム解析により同定した。
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