植物種子細胞に見られるATP依存型翻訳活性の分子機構解明

• 研究課題/領域番号: 16K14665
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 配分区分: 基金
• 研究分野: 分子生物学
• 研究機関: 埼玉大学
• 研究代表者: 戸澤 譲 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (90363267)
• 研究協力者: 鈴木 翔
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2018年度)
• 配分額: 3,640千円 (直接経費: 2,800千円、間接経費: 840千円); 2018年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円); 2017年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円); 2016年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: 無細胞タンパク質合成 / イネ / GTP / カルス / 翻訳 / 翻訳因子 / 植物 / コムギ / 酵母 / 蛋白質 / 生体分子 / 遺伝子 / 酵素

研究成果の概要

本研究では、イネカルス抽出液を利用する無細胞タンパク質合成系を確立した。この系の特性の解析により、GTP無添加条件でのタンパク質合成が可能な一方、抽出液内在性のヌクレアーゼによるmRNA分解で生じるGMPよりGTPが生成することを確認した。そこで、GTPが翻訳に必須か否かを検証するため、Gを含まないpoly(U)を鋳型とする翻訳伸長活性測定を進め、GTP非依存的なペプチド伸長活性を確認するに至った。並行して、酵母の無細胞翻訳系のGTP依存性をイネカルス抽出液のものと比較を行った結果、酵母においてはGTP添加がペプチド伸長活性をより亢進させ、イネの系と明瞭に異なることを確認した。

研究成果の学術的意義や社会的意義

新たに確立したイネカルス無細胞翻訳系は、1 mlあたり数百マイクログラム相当のタンパク質合成が可能で、精製用ヒスチジンタグの利用による合成タンパク質の精製も可能であり、生化学的機能解析用のタンパク質合成系に実用化できる生産性を有すると考える。また、薬害試験の対象となるヒト心筋カリウムチャネルタンパク質hERGの合成について検証したところ、脂質二分子膜ベシクル添加条件で、hERGとその再構成促進因子との共合成により、活性型hERGの効率的再構成系の構築が可能であることを確認した。このように、確立したシステムが、創薬関連タンパク質の機能型再構成系の構築にも資することを確認できた。

研究成果

• [雑誌論文] Novel lineage-specific transmembrane β-barrel proteins in the endoplasmic reticulum of Entamoeba histolytica (2019)
  • 著者名/発表者名: Santos HJ, Imai K, Makiuchi T, Tomii K, Horton P, Nozawa A, Okada K, Tozawa Y, Nozaki T
  • 雑誌名: FEBS J 巻: 印刷中 号: 17 ページ: 3416-3432
  • DOI: 10.1111/febs.14870
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The checkpoint kinase TOR (target of rapamycin) regulates expression of a nuclear-encoded chloroplast RelA-SpoT homolog (RSH) and modulates chloroplast ribosomal RNA synthesis in a unicellular red alga (2018)
  • 著者名/発表者名: Imamura Sousuke、Nomura Yuhta、Takemura Tokiaki、Pancha Imran、Taki Keiko、Toguchi Kazuki、Tozawa Yuzuru、Tanaka Kan
  • 雑誌名: Plant J 巻: 94 号: 2 ページ: 327-339
  • DOI: 10.1111/tpj.13859
  • 査読あり
• [雑誌論文] N-myristoylation and S-acylation are common modifications of Ca2+-regulated Arabidopsis kinases and are required for activation of the SLAC1 anion channel (2018)
  • 著者名/発表者名: Saito Shunya、Hamamoto Shin、Moriya Koko、Matsuura Aiko、Sato Yoko、Muto Jun、Noguchi Hiroto、Yamauchi Seiji、Tozawa Yuzuru、Ueda Minoru、Hashimoto Kenji、Koester Philipp、Dong Qiuyan、Held Katrin、Kudla Joerg、Utsumi Toshihiko、Uozumi Nobuyuki
  • 雑誌名: New Phytologist 巻: 218 号: 4 ページ: 1504-1521
  • DOI: 10.1111/nph.15053
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Mechanically stable solvent-free lipid bilayers in nano- and micro-tapered apertures for reconstitution of cell-free synthesized hERG channels. (2017)
  • 著者名/発表者名: Daisuke Tadaki, Daichi Yamaura, Shun Araki, Miyu Yoshida, Kohei Arata, Takeshi Ohori, Ken-ichi Ishibashi, Miki Kato, Teng Ma, Ryusuke Miyata, Yuzuru Tozawa, Hideaki Yamamoto, Michio Niwano, and Ayumi Hirano-Iwata
  • 雑誌名: Scientific Report 巻: 7 号: 1 ページ: 17736-17736
  • DOI: 10.1038/s41598-017-17905-x
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Cell-free translation system: a tool for producing proteinous nanomachines (2019)
  • 著者名/発表者名: Yuzuru Tozawa
  • 学会等名: 10th International Workshop on Nanostructures & Nanoelectronics
  • 国際学会
• [学会発表] ポリイソプレン鎖合成系の完全インビトロ再構成を目指して (2019)
  • 著者名/発表者名: 戸澤譲
  • 学会等名: 第二回天然ゴム研究会「天然ゴムから考えるバイオマテリアルエンジニアリングのこれから」
• [学会発表] Proteinous nanodevise production based on in vitro translation system (2019)
  • 著者名/発表者名: Yuzuru Tozawa
  • 学会等名: Okinawa Colloids 2019
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] イネ種子胚盤由来のカルスを材料とする無細胞翻訳系の構築 (2018)
  • 著者名/発表者名: 鈴木翔、近藤久海香、松岡聡、戸澤譲
  • 学会等名: 日本農芸化学会2018年度大会
• [学会発表] イネ培養細胞抽出液の試験管内翻訳系の構築 (2017)
  • 著者名/発表者名: 近藤久海香、鈴木翔、戸澤譲
  • 学会等名: 第３５回日本植物細胞分子生物学会大会