| 研究課題/領域番号 |
17013035
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| 研究種目 |
特定領域研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
村上 清史 金沢大学, がん研究所, 教授 (90019878)
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| 研究分担者 |
林 直之 金沢大学, がん研究所, 助手 (50253456)
魏 文祥 金沢大学, がん研究所, 研究員 (20419336)
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| 研究期間 (年度) |
2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
5,400千円 (直接経費: 5,400千円)
2005年度: 5,400千円 (直接経費: 5,400千円)
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| キーワード | HBV X蛋白 / 形質転換能 / 転写修飾 / Oncogene induced Senescence (OIS) / HBVレプリコン / RMP / テロメラーゼ / RPB5 |
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| 研究概要 |
HBV X蛋白(HBx)はRNA polymerase subunit 5 (RPB5)及びTFIIBと相互作用し、転写のcoactivatorとして機能することをin vivo及びin vitro転写系で報告した。我々は、多機能制御蛋白HBxについて、集約型アラニン置換変異(Cm)ライブラリー等を用いて,転写修飾の分子機構、HBVウイルス増殖への役割、ヒト初代細胞への形質転換能の検討を行い、以下の結果を得た。
1)HBxのCm変異ライブラリーの解析により、RPB5結合に必須な配列をcoactivationドメイン内に限定した。この配列は、coactivationに必要な配列の一部の配列であった。HBxの核内標的であるRPB5のCm及び点置換変異(Pm)ライブラリーを用いて、HBxの結合に必須な6残基を特定し、その内4残基はTFIIFサブユニットRAP30との結合にも必須であった。これら4残基の変異酵母RPB5は、増殖温度感受性を示した(J. Biochem(Tokyo),2005)。2)RPB5のDNA結合能を、ゲルシフト法で確認した。結合に必須な残基をRPB5のCm及び点置換変異(Pm)ライブラリーを用いて解析した結果、溶媒に表出したT111が必須で、S113が重要な役割を果たしている結果を得て、RPB5のDNA結合能がRPB5の転写修飾の標的である可能性が提出された(投稿中)。3)ヒト初代細胞の不死化と、ヒト不死化細胞の形質転換にHBxがどのような効果を持つかを解析した。野生型及び各種HBx発現レトルウイルスをヒト初代細胞及びヒト不死化細胞に導入し、不死化率と形質転換率を測定した。その結果、HBxは単独では、ヒト初代細胞の不死化にも、hTERT導入ヒト不死化細胞の形質転換にも影響を与えなかった。しかし、hTERT導入ヒト不死化細胞に活性化型RASの導入による老化誘導(Oncogene-induced senescence : OIS)は、HBxの導入によって克服された。RAS+HBx発現ヒト不死化細胞は、soft agarでコロニー形成能とヌードマウスで造腫瘍性を示した。HBxのOIS克服にはN端ドメインとcoactivationドメインが共に必要であり、coactivationドメイン単独では、不死化の克服は観察されたが、anchorage-independentな増殖と形質転換は観察されなかった(投稿中)。現在HBx Cmライブラリーを用いてOISに必要な配列の特定を行っている。
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