イオンチヤネル・受容体群の「膜上直接相互作用」によるシナプス伝達の調節機構

• 研究課題/領域番号: 17024058
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 生理学研究所
• 研究代表者: 久保 義弘 生理学研究所, 分子生理研究系, 教授 (80211887)
• 研究期間 (年度): 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円); 2005年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
• キーワード: P2X2チャネル / ATP受容体 / 発現密度 / 動的構造変化 / FRET解析

研究概要

我々は、ATP受容体チャネルP2X_2のポアのイオン選択性等の性質が、細胞膜上での発現密度に依存して劇的に変化することを先に報告した。この知見は、発現状況とATPに依存してP2X_2受容体チャネルに著しい構造変化が起こることを示唆するが、現時点でP2X_2受容体チャネルの構造は全く明らかにされていない。P2X_2の構造とその状況依存的変化を知るというゴールに向けて、我々は、P2X_2蛋白のレコンビナント精製と単一粒子構造解析を行った。まず、P2X_2のN-もしくはC-末端にFLAG tagを付加したコンストラクトを作成し、ツメガエル卵母細胞を用いた電気生理学的解析により、正常な機能を持つことを確認した。その後、cDNAをバキュロウイルスベクターに組み込み、昆虫細胞Sf9に感染させ、免疫細胞化学的に細胞膜上での蛋白発現を確認した。大量スケールでの感染Sf9細胞を回収し、膜画分を50mM dodecyl-beta-maltosideを含む溶液で可溶化し、FLAG抗体を含むゲルによりアフィニティ精製した。SDS-PAGEの銀染色により単一のmajor bandを確認した後、ゲル濾過により精製した。その精製産物を用い、グルタルアルデヒドで架橋後、non-denatureゲルにて電気泳動したところ、主たるバンドのサイズからP2X_2蛋白が3量体であることが示された。さらに、ATP投与後、同様な実験を行うと3量体のバンドが上方にシフトした。このシフトは、GTPやアデノシンの投与や、架橋後のATP投与によっては見られなかったため、リガンド結合により、易動度が変わるような構造変化が起こることが示唆された。精製産物のピーク分画を用い、酢酸ウランにより負染色して電顕撮影したところ、単一蛋白粒子像が観察された。単粒子構造解析の手法により、P2X_2蛋白が3量体であることが確認され、また、大きな細胞外領域を持つ逆ピラミッド状の構造をしていることが明らかになった。

研究成果

• [雑誌論文] Dual signaling is differentially activated by different active states of the metabotropic glutamate receptor1a. (2006)
  • 著者名/発表者名: Tateyama, M., Kubo, Y.
  • 雑誌名: Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103 ページ: 1124-1128
• [雑誌論文] Functional roles of charged amino acid residues on the wall of the cytoplasmic pore of Kir2.1. (2006)
  • 著者名/発表者名: Fujiwara, Y., Kubo, Y.
  • 雑誌名: Journal of General Physiology (印刷中)
• [雑誌論文] Towards a view of functioning dimeric metabotropic receptors (2005)
  • 著者名/発表者名: Kubo, Y., Tateyama, M.
  • 雑誌名: Current Opinion in Neurobiology 57 ページ: 509-526
• [雑誌論文] OPA1 expression in the normal rat retina and optic nerve. (2005)
  • 著者名/発表者名: Ju, W.K., Misaka, T., Kushnareva, Y., Nakagomi, S., Agarwal, N., Kubo, Y., et al.
  • 雑誌名: Journal of Comparative Neurology 488 ページ: 1-10
• [雑誌論文] Visualization of the trimeric P2X2 receptor with a crown-capped extracellular domain. (2005)
  • 著者名/発表者名: Mio, K., Kubo, Y., Ogura, T., Yamamoto, T., Sato, C.
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 337 ページ: 998-1005
• [雑誌論文] Protein Kinase C shifts the voltage-dependence of KCNQ/M channels expressed in Xenopus oocytes. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nakajo, K., Kubo, Y.
  • 雑誌名: Journal of Physiology 569 ページ: 59-74