試験管内遺伝子発現系を用いたタンパク質の機能発現プロセスの研究

• 研究課題/領域番号: 17028010
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 上田 卓也 東京大学, 大学院新領域創成創成科学研究科, 教授 (80184927)
• 研究期間 (年度): 2005 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 8,000千円 (直接経費: 8,000千円); 2006年度: 4,000千円 (直接経費: 4,000千円); 2005年度: 4,000千円 (直接経費: 4,000千円)
• キーワード: 生体外蛋白質合成系 / シャペロン / フォールディング / リボソーム / GroEL / GroES / 反転膜小胞

研究概要

リボソーム上で合成された新生ペプチドは、複雑なプロセスをへて、機能を持つ多様な形態の成熟型蛋白質となる。私たちは、近年、翻訳過程に必須な因子のみ構成された試験管内遺伝子発現系PUREsystemを再構築し、蛋白質の誕生プロセスを無細胞化した。このシステムの発展型として蛋白質成熟プロセスに関与する因子群をPURESYSTEMに共存させた複合型無細胞システムを開発し、蛋白質の成熟過程のメカニズム解明することを本研究の目標としている。
まず、新生蛋白質のフォールディングにおける分子シャペロンの役割、および翻訳と共役したフォールディングプロセスを解析するために、フォールディングに関与するシャペロンの共存させたPURESYSTEMを構築した。従来のシャペロンのフォールディングへの関与に関する仮説を検証することを目的として、このシステムを用いた解析を進めている。単鎖抗体(scFv)を用いた実験では、DnaKシステム(DnaK-J/GrpE)とトリガーファクターは、新生蛋白質の可溶化率とその抗原結合活性の向上に著しく効果があり、合成されたscFvの正確な折り畳みを促進することが示された。また、トリガーファクターとDnaKシステムがco-translationalおよびpost-translationalの両プロセスで新生蛋白質の凝集を抑えることが明らかとなった。また、これらのシャペロンの基質となる蛋白質を、大腸菌遺伝子から検索し、シャペロンニン(GroEL/ES)に依存してフォールディングする基質蛋白質-stringent substrate-を見いだした。GroEL/ES-dependentフォールディングプロセスをin vitroで解析したところ、今まで言われたpost-translationalプロセスではなく、新生ポリペプチドーリボソーム-mRNA複合体に結合し、co-translationalプロセスでフォールディングに寄与する可能性が高いことが示された。またsingle-ringのGroELを用いた実験から、GroELが翻訳途中の新生ペプチドに結合し、翻訳終了後にGroESがGroELに結合し、フォールディングを誘導することが示された。

研究成果

• [雑誌論文] Efficient protein selection based on ribosome display system with purified components. (2007)
  • 著者名/発表者名: Ohashi, H., Shimizu, Y., Ying, B.W., Ueda, T.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 352 ページ: 270-276
• [雑誌論文] Ribosomal Protein S1 Is not Essential for the trans-translation Machinery. (2007)
  • 著者名/発表者名: Qi, H., Shimizu, Y., Ueda, T.
  • 雑誌名: J Mol Biol 368 ページ: 845-852
• [雑誌論文] Chaperone properties of mammalian mitochondrial translation elongation factor Tu. (2007)
  • 著者名/発表者名: Suzuki, H., Ueda, T., Taguchi, H., Takeuchi.N.
  • 雑誌名: J Biol Chem 282 ページ: 4076-4084
• [雑誌論文] Co-translational binding of GroEL to nascent polypeptides is followed by post-translational encapsulation by GroES to mediate protein folding. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ying, B.W., Taguchi, H., Ueda, T.
  • 雑誌名: J Biol Chem 281 ページ: 21813-21819
• [雑誌論文] Spermidine inhibits transient and stable ribosome subunit dissociation. (2006)
  • 著者名/発表者名: Umekage, S., Ueda, T.
  • 雑誌名: EBS Lett 580 ページ: 1222-1226
• [雑誌論文] SmpB triggers GTP hydrolysis of elongation factor Tu on ribosomes by compensating for the lack of codon-anticodon interaction during trans-translation initiation. (2006)
  • 著者名/発表者名: Shimizu, Y., Ueda, T.
  • 雑誌名: J Biol Chem 281 ページ: 15987-15996
• [雑誌論文] Spermidine inhibits transient and stable ribosome subunit dissociation. (2006)
  • 著者名/発表者名: Umekage, S., Ueda, T.
  • 雑誌名: FEBS Lett 580(5) ページ: 1222-1226
• [雑誌論文] Co-translational involvement of the chaperonin GroEL in the folding of newly translated polypeptides. (2005)
  • 著者名/発表者名: Ying, B.W., Taguchi, H., Kondo, M., Ueda, T.
  • 雑誌名: J Biol Chem 280(12) ページ: 12035-12040
• [雑誌論文] Esterification of Escherichia coli tRNAs with D-histidine and D-lysine by aminoacyl-tRNA synthetases. (2005)
  • 著者名/発表者名: Takayama, T., Ogawa, T., Hidaka, M., Shimizu, Y., Ueda, T., Masaki, H.
  • 雑誌名: Biosci Biotechnol Biochem 69(5) ページ: 1040-1041
• [雑誌論文] Protein synthesis by pure translation systems. (2005)
  • 著者名/発表者名: Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T.
  • 雑誌名: Methods 36(3) ページ: 299-304
• [雑誌論文] Human mitochondrial mRNAs are stabilized with polyadenylation regulated by mitochondria-specific poly(A) polymerase and polynucleotide phosphorylase. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nagaike, T., Suzuki, T., Katoh, T., Ueda, T.
  • 雑誌名: J Biol Chem 280(20) ページ: 19721-19727
• [雑誌論文] Development of a minimal cell-free translation system for the synthesis of presecretory and integral membrane proteins. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kuruma, Y., Nishiyama, K., Shimizu, Y., Muller, M., Ueda, T.
  • 雑誌名: Biotechnol Prog 21(4) ページ: 1243-1251