マルチカラーレトロウイルスベクターを用いた個体形成時の複数遺伝子競合的機能解析法

• 研究課題/領域番号: 17045005
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 小野寺 雅史 筑波大学, 大学院人間総合科学研究科, 講師 (10334062)
• 研究分担者: 大津 真 東京大学, 医科学研究所, 助手 (30361330)
• 研究期間 (年度): 2005 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 5,600千円 (直接経費: 5,600千円); 2006年度: 2,800千円 (直接経費: 2,800千円); 2005年度: 2,800千円 (直接経費: 2,800千円)
• キーワード: 遺伝子 / ウイルス / 再生医学 / 脳・神経 / 発生・分化 / 蛍光色素蛋白質 / huKo / EGFP / レトロウイルスベクター / 造血幹細胞 / 胚性幹細胞 / 骨髄移植 / VSV-G

研究概要

申請者は以前より各種幹細胞を安定してマーキングできる新規蛍光色素タンパク質を研究しているが、最近、サンゴ(Fungia Concinna)由来の赤色蛍光色素タンパク質Kusabira Orange (KO)がオワンクラゲ由来の緑色蛍光色素タンパク質EGFPと同程度の蛍光高度を発し、また、その波長特性からFACSや蛍光顕微鏡にてEGFPと識別可能であることを見いだした。本研究では以下の実験を行うことで幹細胞マーカーとしてのKO遺伝子の有用性を証明した。
1)Kusabira Orangeのよるマウス造血幹細のマーキング実験
マウス造血幹細胞にレトロウイルスベクターを用いてKO遺伝子を導入し、致死量放射線照射したマウスに移植したところ、これら遺伝子導入細胞は骨髄造血を再構築し、移植後16週を経てもKOの発現を維持していた。さらにEGFPとの多重感染実験において、EGFP^-/huKO^-、EGFP^+/huKO^-、EGFP^-/huKO^+、EGFP^+/huKO^+の4群を確認できたことからKO遺伝子がGFPに続く第二の幹細胞マーカーとして利用できることが示された。
2)Kusabira Orange発現大型動物の作出
遺伝子改変大型動物の作出のため、ブタ由来の線維芽細胞に上記レトロウイルスベクターを用いてKO遺伝子を導入し、そこから抽出した核を成熟させた未受精卵に注入して核融合卵を作成し、胚盤胞まで発生させたのちブタ子宮に移植した。その結果、これら融合卵より対照群(未処理)と同程度の子豚が産出し、また、全身の各臓器に強いKOの発現するブタを複数確認した。現在、他のブタと掛け合わせることでKO発現ブタのライン化を行っている。今回の結果は、KOが核移植由来の卵細胞においても発現が可能で、さらに遺伝子改変大型動物においてしばしば観察される肝、心筋障害が見られないことから、KOはES細胞や核融合卵など個体作出に関与する未熟細胞にも有用なマーカーとして機能することが示唆された。

研究成果

• [雑誌論文] Gene and cell therapy for relapsed leukemia after allo-stem cell transplantation. (2007)
  • 著者名/発表者名: Onodera Masafumi
  • 雑誌名: Gene Therapy ページ: 286-294
• [雑誌論文] Stable transgene expression in mice generated from retrovirally transduced embryonic stem cells. (2007)
  • 著者名/発表者名: Hamanaka S
  • 雑誌名: Mol Ther 15 ページ: 560-565
• [雑誌論文] Interaction of FoxO1 and TSC2 induces insulin resistance through activation of mTOR/p70S6K pathway. (2006)
  • 著者名/発表者名: Cao Y
  • 雑誌名: J. Bio. Chem 281 ページ: 40242-40251
• [雑誌論文] Gene transduction of tristetraprolin or its active domain reduces TNF-alpha production by Jurkat T cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Suzuki E
  • 雑誌名: Int J Mol Med 17 ページ: 801-809
• [雑誌論文] Application of HSVtk suicide gene to X-SCID gene therapy : Ganciclovir treatment offsets gene corrected X-SCID B cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Uchiyama T
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 341 ページ: 391-398
• [雑誌論文] Potent vaccine therapy with dendritic cells genetically modified by the retroviral vector GCDNsap. (2006)
  • 著者名/発表者名: Nabekura T
  • 雑誌名: Molecular Therapy 13 ページ: 301-309
• [雑誌論文] Application of HSVtk suicide gene to X-SCID gene therapy : Ganciclovir treatment offsets gene corrected X-SCID B cells. (2006)
  • 著者名/発表者名: Uchiyama T, Kumaki S, Ishikawa Y, Onodera M, Sato M, Du W, Sasahara Y, Tanaka N, Sugamura K, Tsuchiya S.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 341(2) ページ: 391-398
• [雑誌論文] Potent vaccine therapy with dendritic cells genetically modified by the retroviral vector GCDNsap. (2006)
  • 著者名/発表者名: Nabekura T, Otsu M, Nagasawa T, Nakauchi H, Onodera M.
  • 雑誌名: Molecular Therapy 13(2) ページ: 301-309
• [雑誌論文] The fate of neural progenitor cells expressing astrocytic and radial glial markers in the postnatal rat dentate gyrus. (2005)
  • 著者名/発表者名: Namba T, Mochizuki H, Onodera M, Mizuno Y, Namiki H, Seki T.
  • 雑誌名: Eur J Neurosci 22(8) ページ: 1928-1941
• [雑誌論文] Parvovirus nonstructural proteins induce an epigenetic modification through histone acetylation in host genes and revert tumor malignancy to benignancy. (2005)
  • 著者名/発表者名: Iseki H, Shimizukawa R, Sugiyama F, Kunita S, Iwama A, Onodera M, Nakauchi H, Yagami K.
  • 雑誌名: J Virol 79(14) ページ: 8886-8893
• [雑誌論文] Possibility for neurogenesis in substantia nigra of parkinsonian brain. (2005)
  • 著者名/発表者名: Yoshimi K, Ren YR, Seki T, Yamada M, Hayakawa H, Ooizumi H, Onodera M, Saito Y, Murayama S, Okano H, Mizuno Y, Mochizuki H.
  • 雑誌名: Ann Neurol 58(1) ページ: 31-40
• [雑誌論文] An in vivo assay for retrovirally transduced human peripheral T lymphocytes using non-obese diabetic/ severe combined immunodeficiency mice. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kaneko S, Nagasawa T, Nakauchi H, Onodera M.
  • 雑誌名: Exp Hematol 33(1) ページ: 35-41