マウスES細胞の細胞周期因子制御と未分化性維持機構の解析

• 研究課題/領域番号: 17045040
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: (財)東京都医学研究機構
• 研究代表者: 正井 久雄 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 参事研究員 (40229349)
• 研究期間 (年度): 2005 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 5,200千円 (直接経費: 5,200千円); 2006年度: 2,600千円 (直接経費: 2,600千円); 2005年度: 2,600千円 (直接経費: 2,600千円)
• キーワード: 胚性幹細胞 / 細胞周期 / Oct3転写因子 / E2F転写因子 / 分化誘導 / タンパク質分解

研究概要

未分化マウス胚性幹細胞(以下ES細胞)の細胞周期進行は、分化細胞のそれとは際立って異なる。増殖サイクルは10時間程であり、大部分S期とM期からなり、G1期とG2期は大変短い。ES細胞の自己複製はこのような特徴的な細胞周期進行の上になりたっており、未分化能の維持も細胞周期制御と関連していると考えられているが、その分子基盤に関する研究は少ない。
我々は、未分化マウスES細胞と胚性繊維芽細胞とにおいて、種々の複製因子および細胞周期制御因子の発現レベルを比較した結果、ES細胞ではCdc6(M期終期に複製準備複合体の形成に必須)、ASK(Cdc7キナーゼの活性化サブユニット;S期の開始と進行に必須)、CyclinA(S期からG2/Mへの移行に必須)およびCyclinB(M期の開始に必須)の4つのタンパク質が大量発現していることを見出した。また、これらの因子の発現量は、ES細胞の分化誘導に伴い急速に低下した。以上の結果から、これらの複製制御因子の協調的な大量発現により未分化ES細胞に特有の細胞周期制御が支持される可能性が示唆された。体細胞の細胞周期においてCdc6はG1期初期にユビキチンリガーゼAPC/Cdh1を介したタンパク質分解を受けるが、ES細胞では細胞周期を通じて安定に保たれる。我々は、ES細胞ではAPC/Cdh1の活性阻害因子であるEmi1が大量発現しており、その発現レベルは分化誘導により急激に低下することを見い出した。Emi1の転写制御領域にはE2F転写因子結合部位が複数個存在し、そのプロモーター活性はE2F1-3により顕著に活1生化される。プロモーターの変異解析から一方、未分化細胞ではE2Fが促進的な複合体を形成するが、分化誘導により抑制型の複合体に変換されることが明らかとなった。Emi1をsiRNAでノックダウンすると、CyclinA, BおよびGemininなどの発現量が低下するがCdc6は変化しない。このことからCdc6とこれらの因子はタンパクレベルで異なる制御をうけている可能性が示唆された。Emi1の大量発現がES細胞の分化誘導にどのような影響を与えるかにっいて現在検討している。また、これらの因子の細胞周期変動について、蛍光タンパクとの融合分子を用いて解析している。

研究成果

• [雑誌論文] Structural basis of the 3'-end recognition of a leading strand in stalled DNA replication forks by PriA. (2007)
  • 著者名/発表者名: Sasaki, K.
  • 雑誌名: EMBO J. (印刷中)
• [雑誌論文] Escherichia coli PriA protein : Two modes of DNA binding and activation of ATP hydrolysis. (2007)
  • 著者名/発表者名: Tanaka, T.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. (印刷中)
• [雑誌論文] Human Tim/Timeless-interacting protein, Tipin, is required for efficient progression of S phase and DNA replication checkpoint. (2007)
  • 著者名/発表者名: Yoshizawa-Sugata, N.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 282 ページ: 2729-2740
• [雑誌論文] Phosphorylation of MCM4 by Cdc7 kinase facilitates its interaction with Cdc45 on the chromatin. (2006)
  • 著者名/発表者名: Masai H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 281 ページ: 39249-32961
• [雑誌論文] Replication initiation from a novel origin identified in the Th2 cytokine cluster locus requires a distant conserved non-coding sequence. (*cocommunicating authors) (2006)
  • 著者名/発表者名: Hayashida, T.
  • 雑誌名: J.Immunol. 176 ページ: 5446-5454
• [雑誌論文] Rad3-Cds1 mediates coupling of initiation of meiotic recombination with DNA replication : Mei4-dependent transcription as a potential target of meiotic checkpoint. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ogino, K.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 281 ページ: 1338-1344
• [雑誌論文] Stabilization of a stalled replication fork by concerted actions of two helicases. (2006)
  • 著者名/発表者名: Tanaka, T.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 281 ページ: 3484-3493
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary crystallographic analysis of the N-terminal domain of PriA from Escherichia coli. (2006)
  • 著者名/発表者名: Sasaki, K.
  • 雑誌名: Biochim.Biophys.Acta. 1764 ページ: 157-160
• [雑誌論文] Nuclear import of Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen 1 mediated by NPI-1 (Importin α5) is up- and down-regulated by phosphorylation of the nuclear localization signal for which Lys379 and Arg380 are essential. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kitamura, R.
  • 雑誌名: J.Virol. 80 ページ: 1979-1991
• [雑誌論文] Hsk1 kinase is required for induction of meiotic double-stranded DNA breaks without involving checkpoint kinases in fission yeast. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ogino, K., Hirota, K., Matsumoto, S., Takeda, T., Ohta, K., Arai, K., Masai, H.
  • 雑誌名: Proc.Natl.Acad.Sci.USA (印刷中)(accepted for publication)
• [雑誌論文] Replication initiation from a novel origin identified in the Th2 cytokine cluster locus requires a distant conserved non-coding sequence. (*cocommunicating authors) (2006)
  • 著者名/発表者名: Hayashida, T., Oda, M., Ohsawa, K., Yamaguchi A., Giacca, M., Locksley, R.M., Masai H., Miyatake, S.
  • 雑誌名: J.Immunol. (印刷中)
• [雑誌論文] Rad3-Cds1 mediates coupling of initiation of meiotic recombination with DNA replication : Mei4-dependent transcription as a potential target of meiotic checkpoint. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ogino, K., Masai, H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 281 ページ: 1338-1344
• [雑誌論文] Stabilization of a stalled replication fork by concerted actions of two helicases. (2006)
  • 著者名/発表者名: Tanaka, T., Masai, H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 281 ページ: 3484-3493
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary crystallographic analysis of the N-terminal domain of PriA from Escherichia coli. (2006)
  • 著者名/発表者名: Sasaki, K., Ose, T., Tanaka, T., Mizukoshi, T., Ishigaki, T., Maenaka, K., Masai, H., Kohda, D.
  • 雑誌名: Biochim.Biophys.Acta. 1764 ページ: 157-160
• [雑誌論文] Nuclear import of Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen 1 mediated by NPI-1 (Importin ・5) is up- and down-regulated by phosphorylation of the nuclear localization signal for which Lys379 and Arg380 are essential. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kitamura, R., Sekimoto, T., Ito, S., Harada, S., Yamagata, H., Masai, H., Yoneda, H., Yanagi, K.
  • 雑誌名: J.Virol. 80 ページ: 1979-1991
• [雑誌論文] Cell cycle and developmental regulations of replication factors in mouse embryonic stem cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Fujii-Yamamoto, H., Kim, J-M., Arai, K., Masai, H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280 ページ: 12976-12987
• [雑誌論文] A second human Dbf4/ASK-related protein, Drf1/ASKL1 is required for efficient completion of S and M phases. (2005)
  • 著者名/発表者名: Yoshizawa, N., Ishii, A., Taniyama, C., Matsui, E., Arai, K., Masai, H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280 ページ: 13062-13070
• [雑誌論文] Functional analyses of mouse ASK, an activator subunit for Cdc7 kinase, using conditional ASK knockout ES cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Yamashita, N., Kim, J-M., Koiwai, O., Arai, K., Masai, H.
  • 雑誌名: Genes to Cells 50 ページ: 551-563
• [雑誌論文] DNA binding and helicase actions of mouse Mcm4/6/7 helicase. (2005)
  • 著者名/発表者名: You, Z., Masai, H.
  • 雑誌名: Nucl.Acids Res. 33 ページ: 3033-3047
• [雑誌論文] Novel human origins of DNA replication selected from a library of nascent DNA. (2005)
  • 著者名/発表者名: Todorovic, V., Giadrossi, S., Pelizon, C., Masai, H., Giacca, M.
  • 雑誌名: Mol.Cell 19 ページ: 567-575
• [雑誌論文] Hsk1-Dfp1/Him1, the Cdc7-Dbf4 Kinase in Schizosaccharomyces pombe, associates with Swil, a component of the replication fork protection complex. (2005)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto, S., Ogino, K., Noguchi, E., Russell, P., Masai, H.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280 ページ: 42536-42542
• [雑誌論文] Control of DNA replication : regulation and activation of eukaryotic replicative helicase, MCM. (2005)
  • 著者名/発表者名: Masai, H., You, Z., Arai, K.
  • 雑誌名: IUBMB Life 57 ページ: 323-335
• [図書] 「染色体サイクル」「染色体サイクル : 複製・分配・組換え・修復・クロマチン制御のメカニズムとその異常による疾患」」序文(実験医学 増刊号) (2007)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄
  • 総ページ数: 219
  • 出版者: 羊土社
• [図書] 概論"染色体サイクル制御の分子メカニズム"実験医学 増刊号「染色体サイクル」 (2007)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄, 渡邊嘉典
  • 総ページ数: 219
  • 出版者: 羊土社
• [図書] "MCMタンパク質のDNAZ複製における役割"実験医学 増刊号「染色体サイクル」 (2007)
  • 著者名/発表者名: Zhiying You, 正井久雄
  • 総ページ数: 219
  • 出版者: 羊土社
• [図書] Cdc7キナーゼによる複製フォーク制御"実験医学増刊号「染色体サイクル」 (2007)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄, 松本清治
  • 総ページ数: 219
  • 出版者: 羊土社
• [図書] ヒトの分子生物学(村松正實 監訳) (2006)
  • 著者名/発表者名: 正井久雄(翻訳分担)
  • 総ページ数: 715
  • 出版者: 丸善株式会社
• [図書] 体細胞分裂に重要な役割を果たす分裂酵母Cdc7類似キナーゼ,Hsk1タンパク質は減数分裂期組換えの開始に必要とされる"細胞工学 (2006)
  • 著者名/発表者名: 荻野桂子, 廣田耕志, 太田邦史, 正井久雄
  • 出版者: 秀潤社