ラフトのコレステロールに結合するPFOタンパク質の構造遷移と相互作用様式の解明

• 研究課題/領域番号: 17048009
• 研究種目: 特定領域研究
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 片平 正人 横浜市立大学, 国際総合科学研究科, 教授 (70211844)
• 研究分担者: 岩下 淑子 財団法人東京都高齢者研究福祉振興財団, 東京都老人総合研究所, 副参事研究員 (50111498)
• 研究期間 (年度): 2005 – 2006
• 研究課題ステータス: 完了 (2006年度)
• 配分額: 6,400千円 (直接経費: 6,400千円); 2006年度: 3,200千円 (直接経費: 3,200千円); 2005年度: 3,200千円 (直接経費: 3,200千円)
• キーワード: ラフト / PFOタンパク質 / コレステロール / NMR / 構造 / リポソーム / イオンチャネル / 核酸 / 生体分子 / 生物物理 / 蛋白質 / 立体構造 / 膜

研究概要

PFOタンパク質を用いたラフトの細分化及び構造解析に向けた試料調製の改良
従来「ラフト画分」として用いられてきた界面活性剤に不溶性の低密度膜画分から、コレステロール含有率の高い膜サブセットを分離する手法を確立した。この手法を用いてJurkat細胞から分離したBC-PFO結合性のラフト膜サブセットには、フロチリン、ガングリオシドGM1等のラフトマーカー分子の他に、Lck, LAT, PAG等のT細胞情報伝達を正・負に制御する分子群が検出された。一方、受容体刺激による活性化に伴って、BC-PFO結合性の膜領域に移行してくる分子の存在も明らかになった。
PFOタンパク質の構造及びコレステロール・脂質との相互作用様式の解析を、ドメイン4(D4)を用いて進行させた。大腸菌の菌体破砕液の不溶性画分に存在するD4を、アルギニン法によってリフォールディングする事で、これまでに100FMの濃度のD4試料を安定して調製できるようになっていた。今回さらに試料調製法の改良(凝集防止剤(本領域の群馬大学・若松先生よりご提供)の添加、リフォールディング・濃縮工程の修正、サンプル管のシリコン加工等)を行った結果、500μMの濃度のD4試料を得る事に成功した。タンパク質の安定性に関しても、調製されたタンパク質はこれまで数時間程度しか良好なスペクトルを与えなかったが、今回それを1週間程度まで伸ばす事に成功した。現在この試料を用いて3次元スペクトルの測定を行い、主鎖の帰属を進行させている。

研究成果

• [雑誌論文] Structure of human telomeric DNA under physiological ionic conditions stabilized by proper incorporation of 8-bromoguanosines, as determined by NMR (2007)
  • 著者名/発表者名: Matsugami, M他
  • 雑誌名: FEBS J (印刷中)
• [雑誌論文] Unichrom, a novel nuclear matrix protein, binds to the Ars insulator and canonical MARs (2006)
  • 著者名/発表者名: Tagashira, H他
  • 雑誌名: Zoological Science 23 ページ: 9-21
• [雑誌論文] Structural property of DNA that migrates faster in gel electrophoresis, as deduced by CD spectroscopy (2006)
  • 著者名/発表者名: Matsugami, A他
  • 雑誌名: Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 25 ページ: 417-425
• [雑誌論文] Identification of 2-(cysteinyl) amido-2-deoxy-D-galacturonic acid residue from the sheath of Leptothrix cholodnii (2006)
  • 著者名/発表者名: Makita, H他
  • 雑誌名: Biosci. Biotech. ＆ Biochem 70 ページ: 1265-1268
• [雑誌論文] Molecular mechanism for maintenance of G-rich short tandem repeats capable of adopting G4 DNA structures (2006)
  • 著者名/発表者名: Nakagama, H他
  • 雑誌名: Mutat. Res 598 ページ: 120-131
• [雑誌論文] NMRによるタンパク質構造解析の展望 (2006)
  • 著者名/発表者名: 宮ノ入洋平他
  • 雑誌名: 酵素工学ニュース 55 ページ: 29-34
• [雑誌論文] Structural analysis of DNA containing (6-4) photoproduct in complex with distamycin A by NMR (2006)
  • 著者名/発表者名: Tsuchibayashi, H他
  • 雑誌名: Nucleic Acids Symp. Ser. 50 ページ: 237-238
• [雑誌論文] The new models of the human telomere DNA in K^+ solution revealed by NMR analysis assisted by the incorporation of 8-bromoguanines (2006)
  • 著者名/発表者名: Matsugami, A他
  • 雑誌名: Nucleic Acids Symp. Ser 50 ページ: 42-43
• [雑誌論文] a novel nuclear matrix protein, binds to the Ars insulator and canonical MARs (2006)
  • 著者名/発表者名: Tagashira, H., Shimotori, T., Sakamoto, N., Katahira, M., Miyanoiri, Y., Yamamoto, T., Mitsunaga-Nakatsubo, K., Kusunoki, S., Akasaka, K., Unichrom
  • 雑誌名: Zoological science 23 ページ: 9-21
• [雑誌論文] Structural property of DNA that migrates faster in gel electrophoresis, as deduced by CD spectroscopy, Nucleosides (2006)
  • 著者名/発表者名: Matsugami, A., Tani, K., Ouhashi, K., Uesugi, S., Morita, M., Ohyama, T., katahira M.
  • 雑誌名: Nucleotides and Nucleic Acids (in press)
• [雑誌論文] Identification of 2-(cysteinyl)amido-2-deoxy-D-galacturonic acid residue from the sheath of Leptothrix cholodnii (2006)
  • 著者名/発表者名: Makita, H., Nakahara, Y., Fukui, H., Miyanoiri, Y., Katahira, M., Seki, H., Takeda, M., Koizumi, J.
  • 雑誌名: Biosci.Biotech.& Biochem (in press)
  • NAID: 10018531700
• [雑誌論文] Molecular mechanism for maintenance of G-rich short tandem repeats capable of adopting G4 DNA structures (2006)
  • 著者名/発表者名: Nakagama, H., Higuchi, K., Tanaka, E., Tsuchiya, N., Nakashima, K., Katahira, M., Fukuda, H.
  • 雑誌名: Mutat.Res. (in press)
• [雑誌論文] Structure of hnRNP D : single-stranded telomere DNA complex and unfolding of quadruplex by hnRNP D (2005)
  • 著者名/発表者名: Enokizono, Y., Konishi, Y., Uesugi, S., Ishikawa, F., Katahira, M.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280 ページ: 18862-18870
• [雑誌論文] H., Unfolding T higher DNA structures formed by the d(CGG) triplet repeat by UP1 protein (2005)
  • 著者名/発表者名: Fukuda, H., Katahira, M., Tanaka, E., Enokizono, Y., Tsuchiya, N., Higuchi, K., Nagao, M., Nakagama
  • 雑誌名: Genes Cells 10 ページ: 953-962
• [雑誌論文] P.K.R., Human vault-associated non-coding RNAs bind to mitoxantrone, a chemotheraneutic compound (2005)
  • 著者名/発表者名: Gopinath, S.C.B., Matsugami, A., Katahira.M., Kumar
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res. 33 ページ: 4874-4881
• [雑誌論文] Structure of RNA aptamer complexed with an RNA-binding peptide of Tat with aid of residue-epecific ^<13>C, ^<15>N labeling (2005)
  • 著者名/発表者名: Matsugami, A., Tochio, H., Niyada, E., Tamura, Y., Kudo, M., Misono, T., Kumar, P., Katahira, M.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Res.Suppl. 5 ページ: 69-70
• [雑誌論文] Separation of a cholesterol-enriched microdomain involved in T-cell signal transduction (2005)
  • 著者名/発表者名: Shimada, Y., Inomata, M., Suzuki, H., Hayashi, M., Waheed, A.A., Ohno-Iwashita, Y.
  • 雑誌名: FEBS J. 272 ページ: 5454-5463
• [雑誌論文] Role for upregulated ganglioside biosynthesis and association of Src family kinases with microdomains in retinoic acid-induced differentiation of F9 embryonal carcinoma cells (2005)
  • 著者名/発表者名: Sato, T., Zakaria, A.M., Uemura, S., Ishii, A., Ohno-Iwashita, Y., Igarashi, Y., Inokuchi.JI.
  • 雑誌名: Glycobiology 15 ページ: 687-699
• [雑誌論文] Structure an function of lipid rafts in human activated T cells' (2005)
  • 著者名/発表者名: Tani-ichi, S., Maruyama, K., Kondo, N., Nagafuku, M., Kabayama, K., Inokuchi, J., Shimada, Y., Ohno-Iwashiita, Y., Yagita, H., Kawano, S., Kosugi, A.
  • 雑誌名: International Immunology 17 ページ: 749-758
• [雑誌論文] Adhesive surface determines raft composition in platelets adhered under flow (2005)
  • 著者名/発表者名: van Lier, M., Lee, F., Farndale, R.W., Gorter, G., Verhoef, S., Ohno-Iwashita, Y., Akkerman, J.W.N., Heijnen, H.F.G
  • 雑誌名: J.Thromb.Haemost 3 ページ: 2514-2525
• [図書] 生物物理学ハンドブック(分担) (2007)
  • 著者名/発表者名: 片平正人
  • 出版者: 朝倉書店
• [図書] 第5版 実験化学講座8NMR・ESR(分担) (2006)
  • 著者名/発表者名: 片平正人
  • 出版者: 丸善