牛脾臓プロテアソームおよびユビキチン関連酵素システムの複合体構造研究

研究課題

研究課題/領域番号	17053011
研究種目	特定領域研究
配分区分	補助金
審査区分	生物系
研究機関	京都大学
研究代表者	森本幸生京都大学, 原子炉実験所, 教授 (80200450)
研究期間 (年度)	2005
研究課題ステータス	完了 (2005年度)
配分額 *注記	3,000千円 (直接経費: 3,000千円) 2005年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
キーワード	プロテアソーム / 超分子複合体 / 結晶構造解析 / 分子凝集 / ユビキチン
研究概要	哺乳類のプロテアソームは14種のヘテロサブユニット28個から成る分子量75万の多機能タンパク質分解酵素複合体であり免疫応答系システムでもある。ここでは免疫型プロテアソームを牛脾臓から抽出し、またユビキチン付加によって分解シグナルを持った基質タンパク質およびユビキチン活性化酵素のユビキチンを介した強固な複合体形成機構を解明することを目的とした。そのために放射光による結晶構造解析を行い、粒子全体の動き、様態については中性子散乱を用いた。牛脾臓2Kgから20Sプロテアソームの精製を行い、最終精製試料約20mgを得た。動的光散乱によってサンプルの分散性を確認し結晶化を行った。MPDを沈殿剤とし、Mg存在下で0.02mm程度の透明板状結晶を得た。これは板状晶が何枚も重なったものでそれをはがしてSPring8蛋白研BLにて回折実験を行った。分解能は約4Åまで観測できたが、回折斑点が割れており、構造解析に至る全データ収集には至らなかった。ユビキチン活性化・接合酵素についてはそれぞれマウス由来E1、ヒト由来E2について、昆虫細胞、大腸菌によって発現させ、精製・結晶化を行った。全長1100残基からなるE1についてはPEGを沈殿剤として針状晶が得られた。放射光による回折実験では分解能8Åの反射が得られたが、これ以上の分解能でのデータ収集には至っていない。E2については25Kフラグメントとして200残基からなる試料として結晶化を行った。PEGを沈殿剤として柱状晶が得られ回折データ収集を行った。分解能は3Åであり2量体として構造決定した。この2量体は生理活性状態とは無関係な会合であると考えられ、現在精密化を進めるとともに、さらに高分解能データ収集に向けた結晶化を行っている。これらとともにタンパク質の凝集過程を超遠心分析、X線・中性子散乱法によって明らかにするため実験、解析を行い、粒子形状およびその解析方法などを考察した。