| 研究課題/領域番号 |
17209051
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
整形外科学
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| 研究機関 | 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪府立成人病センター(研究所) |
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研究代表者 |
高橋 克仁 大阪府立成人病センター, 研究所, 部長 (40211338)
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| 研究分担者 |
吉川 秀樹 大阪大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (60191558)
山村 倫子 大阪府立成人病センター, 研究所, 主任研究員 (50342994)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
30,160千円 (直接経費: 23,200千円、間接経費: 6,960千円)
2006年度: 11,570千円 (直接経費: 8,900千円、間接経費: 2,670千円)
2005年度: 18,590千円 (直接経費: 14,300千円、間接経費: 4,290千円)
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| キーワード | ヘルペスウイルス / カルポニン / 肉腫 / 遺伝子治療 / GMP基準 / GMP |
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| 研究概要 |
ウイルス遺伝子治療薬の開発には効力試験と生物学的評価試験が必要である。また、臨床試験に使用するウイノスのGMP準拠精製は、1)マスターセルバンクの構築と検定、2)マスターウイルスシードストックの作成とその検定、3)臨床試験用のウイルス産生とその検定、の3つのステップからなり、中でも、マスターセルバンクの構築は安全かつ効率的にウイルスストックを得るための最も重要なステップである。本研究では、臨床に即応した効力試験を実施するための患者検体からのヒト肉腫初代培養細胞の樹立と、ウイルス塩基配列の決定や生物学的評価試験を実施するためのウイルス産生細胞のマスターセルバンクの元となるシードセルストックの作製を目的とした。ヒト肉腫手術標本から初代培養肉腫細胞9クローンを樹立した後、SCIDマウスの背部皮下または胸腔内、腹腔内に移植可能な細胞株を選別しdl2. cALPΔRRのin vitroおよびin vivoでの効力試験を実施した。Hsv-1の産生細胞として用いられているアフリカミドリザル腎臓由来Vero細胞でのタンパク質発現系にあわせてコドンの使用頻度、GC塩基の含量などを最適化し塩基配列を設計した人工合成HSV-IICP4遺伝子(3897bp)の上流にHSV-1の内在性発現制御配列を連結し、下流にpolyA配列(74bp)、SV40エンハンサー/プロモーター、イントロン、ネオマイシン耐性遺伝子(795bp)、イントロン、PolyA配列の順で連結したDNAを全人工合成した。無菌環境下閉鎖系アイソレーターを用いて、エンドトキシン試験及び無菌試験を経た人工合成DNAをリポフェクション法で生物学的評価試験に合格した129継代Vero細胞に遺伝子導入した。ICP4mRNAと蛋白を安定に発現し得るG418耐性Vero細胞を選別クローン化し、高力価のICP4欠失HSV-1を産生するシードセルストック8本(8.80x10^6/本)を作成した。Real-time PCR法でシードセルストックのリボヌクレオチド還元酵素及びICP4 mRNAの発現を定量し、無血清培養条件での細胞特性を解析した。
臨床試験用の薬剤として製造する場合、ウイルスの単一クローンから可能な限り均一なゲノムDNAを精製することが好ましい。大腸菌内で単一クローンのウイルスDNAを増幅可能なBACmid挿入ベクターを用いたゲノムDNAのクローニングと塩基配列決定を進めるため、上記シードセルストックの無血清培養に、肉腫標的破壊HSV-1、d12.CALPΔRRを、感染させ、そのゲノムDNAを精製した。
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