研究課題
基盤研究(C)
DNA損傷に対する遺伝子防御機構に小胞体タンパクが関わるという報告は、これまで極めて少ない。申請者らは、アンチセンスDNA導入による発現抑制実験により、小胞体シャペロンである78-kDa glucose-regulated protein(GRP78)が、紫外線損傷DNAの修復過程に関与することにより、紫外線誘導細胞死を抑制する可能性を見いだした。本研究では、GRP78の紫外線応答への関与の詳細を解明することとし、下記の結果を得た。1)紫外線損傷プラスミドを基質に用いたin vitro修復活性を構築した。この系を使用し、GRP78発現抑制細胞の全細胞抽出液ではコントロール細胞の抽出液に比べ、修復活性が低下していることを確認した。しかし、発現抑制細胞の全細胞抽出液にrecombinant GRP78(ハムスター由来)を加えても、修復活性の回復は認められず、逆に、コントロール細胞抽出液から免疫沈降によりGRP78を除去しても、修復活性の低下は観察されなかった。2)GRP78発現抑制細胞の全細胞抽出液ではコントロール細胞抽出液に比べ、修復酵素XPAのタンパク質量が低下していた。3)GRP78の紫外線による発現量変化は報告されていない。そこで、紫外線照射後の細胞内GRP78タンパク質量の変化をWestern解析で調べた。タンパク質量は、照射24時間後までは減少するが、48時間以後増加することがわかった。また、色素タンパク質GFPを融合させたGRP78-GFPタンパク質を培養ヒト細胞内に発現させ、蛍光顕微鏡下で紫外線照射前後の局在を調べた。核周辺への局在が観察されたが、照射前後で顕著な局在の変化は認められなかった。4)紫外線以外のDNA損傷因子として、X線、DNA架橋剤であるcisplatinとcarmustineに対する感受性を調べた。X線とcarmustineに対する致死感受性には発現抑制細胞とベクターコントロール細胞間に大きな差はみられなかったが、cisplatin感受性が発現抑制細胞で増加していることを見出した。以上の結果は、小胞体シャペロンGRP78の紫外線応答への関与を強く支持する。GRP78の修復過程への関与の詳細な機構は未だ不明である。しかし、上記の結果から、修復系に直接関与するのではなく、修復酵素の安定化あるいは核内代謝調節を介して間接的に関与する可能性が考えられる。
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