| 研究課題/領域番号 |
17510073
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 応募区分 | 一般 |
|---|
| 研究分野 |
環境技術・環境材料
|
|---|
| 研究機関 | 東京理科大学 |
|---|
研究代表者 |
峯木 茂 東京理科大学, 理工学部, 准教授 (40120216)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
|
| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
|
| 配分額 *注記 |
3,900千円 (直接経費: 3,900千円)
2006年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
2005年度: 3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
|
|---|
| キーワード | pyrene / Mycobacterium / dioxygenase / 16S-rRNA / FISH / ピレン / 多環芳香族炭化水素 / 土壌汚染 / モニタリング |
|---|
| 研究概要 |
ピレン資化性細菌Mycobacterium sp.H2-5を無機培地でピレンを炭素源として培養し、ピレン分解に関与するジオキシゲナーゼ(ピレン酸化酵素)のサブユニットであるNidAとNidBを取得した。NidBはピレン分解時に特異的であり、大サブユニットNidAと結合してジオキシゲナーゼを構成するとされているので、この遺伝子がピレン資化能のプローブとして利用できそうであった。N末端付近のアミノ酸配列情報から当該タンパク質の遺伝子nidAとnidBを獲得して、塩基配列を決定した。次いで、その配列情報から蛍光標識したプローブを作製し、蛍光in situ hybridization(FISH)解析をする予定であったが、標的となるmRNA量が少ないためにやや難しいと考えられたので、先ずは豊富に存在すると考えられる、16S rRNAに対するFISHを試みることにした。
H2-5株のFISHに先立ち、E.coilに対して、Alexa Fluore 488で5'末端を蛍光ラベルしたユニバーサルプローブEUB338およびアンチセンスであるNONEUBを用いてFISHを行った。菌体をパラホルムアルデヒドで固定し、ゼラチンコートしたスライド上に結合させた。次に、上記プローブをハイブリしたのち、蛍光顕微鏡で観察した結果、EUBとDAPIに関して、明瞭なシグナルをうることができた。次いで、TSB栄養培地で純粋培養したH2-5株のFISHを同様な方法で行った。その結果、EUB338とDAPIで強いシグナルが得られたものの、E.coliに比べると不明瞭であった。現在、シリコナイズしたスライドガラスを用いてlysozymeとachromopeptidase処理をしてプローブの浸透性を向上させるべく、実験を継続している。
|
