| 研究課題/領域番号 |
17550149
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生体関連化学
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
中村 暢文 東京農工大学, 大学院共生科学技術研究院, 助教授 (60313293)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2006年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2005年度: 2,600千円 (直接経費: 2,600千円)
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| キーワード | チトクロムP450 / 酸化還元反応 / 共鳴ラマンスペクトル / 部位特異的変異 / タンパク質固定化 / 電気化学的触媒反応 / ヘムタンパク質 / イオン液体 / シトクロムP450 / 酸化還元電位 / 直接電気化学 / タンパク質固定化法 / サイクリックボルタンメトリー / 表面増強共鳴ラマンスペクトル / 酵素 / 触媒反応 / 非水溶媒 / 化学修飾 |
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| 研究概要 |
チトクロムP450(P450)の電極との直接電子移動を観測する手法を確立し、変異導入したP450の酸化還元電位の測定から、酸化還元電位に及ぼす影響を探る。本研究では、耐熱性のP450を用い、電極による電子移動制御を可能とする方法を確立することを第一の目的としている。DDABにチトクロムPP450を加えて作製したフィルムについて、共鳴ラマン分光法を用いて調べた。その結果、補酵素であるヘムがポリペプチドから放出されていた。このことが基質の電気化学的触媒反応が観測されなかった理由であった。一方、レイヤー-バイ-レイヤー法により、PFC電極上にポリエチレンイミンを用いて作製したフィルム中では、チトクロムP450の構造は維持され、基質であるラウリックアシッドの結合も観測されることを明らかにし、電気化学的触媒活性が観測されることと対応付けることができた。また、新規な直接電気化学法を検討し、ポリエチレンオキシド修飾したP450を用いてキャスト固定するという簡便な方法で酸化還元応答を得ることもできた。
ヘム近傍の残基に変異を導入することにより、酸化還元電位を調節することが可能であることを確かめるため、Phe310とAla320を、それぞれAlaとGlnに置換したF310A変異体、A320Q変異体及びF310A/A320Q変異体を作製した。これらの変異体の酸化還元電位を、ジチオナイトを還元剤として用いて算出した。野生型と比較して、Phe310に変異を導入した2つの変異体の酸化還元電位が、正側に約40mVシフトすることが判明し、310の位置のアミノ酸が酸化還元電位の制御に重要であることを明らかに出来た。最後に、イオン液体のみにとけ、水に溶けないP450を作製することができた。
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