| 研究概要 |
当該研究は,分子インプリント法を応用して,蛋白質のリフォールディングの促進および耐熱化蛋白質のセレクションを行うことを目的とする。
本研究では,まず3-Aminophenylboronic acidを加えて重合させることにより,リゾチームと特異的に結合する分子インプリンティングポリマー(MIP)を作成した。このMIPを用いて,尿素変性したリゾチームのリフォールディングに対する効果を解析した。その結果,MIPを加えない場合よりリゾチームのリフォールディング効率は低下してしまった。その原因として,変性したリゾチームがMIPの疎水性の部分に結合した可能性が考えられる。そこで,より親水的なアクリルアミドを用いて作成したMIP存在下において変性還元リゾチームのリフォールディングを行い,活性の回復を測定した。その結果,MIPを加える量の増加に伴いリフォールディング率も増加し,最終的に約90%のリフォールディングがみられた。これに対し,リゾチーム無添加条件下で作成したnon-MIPを加えてもリフォールディングはみられなかった。従って,MIPが変性還元リゾチームと特異的に結合し,リフォールディングを促進したと考えられる。一方,同様に変性還元ペプシンのリフォールディングを行ったところ,CDスペクトルはほぼネイティブ状態と同様のところまで回復したが,活性の回復は15%にとどまった。従って,正しくリフォールディングした分子の割合は少ないと考えられる。さらに,RNase HI耐熱化変異体のMIPへの選択的結合実験を行った。野生型,変異体混合蛋白質溶液を調製し,50〜65℃の範囲で加熱したところ,室温では両蛋白質ともMIFとの結合がみられたが,加熱温度60℃以上においては,変異体のみ結合がみられた。従って,熱変性しない変異体のみがMIPが選択的に結合することが示された。
|
