| 研究課題/領域番号 |
17570111
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
機能生物化学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
柳川 伸一 京都大学, ウイルス研究所, 助手 (70183978)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2006年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
2005年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
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| キーワード | RNAi / Wnt / Wingless / シグナル伝達 / ゲノム / 培養細胞 / Reporter Assay |
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| 研究概要 |
本研究では、Drosophila培養細胞S2R+を用いたRNAiによって、Wingless(Wg)経路の構成員を網羅的に検索する事を目的とした。384well plate僅か50枚を使ってDrosphilaの全遺伝子をカバーする系の確立を目指した。
1 スクリーニングシステムの設計と検証
TCF転写因子の結合配列を導入したFirefly Reporter PlasmidとS2R+細胞10万個で、再現性良くAssay可能であった。Wg刺激により誘導されたFirefly luciferase reporter活性を著しく阻害するdsRNAに対応する遺伝子をWg経路の正の制御因子と判定し、Wg非存在下、あるいは低ドーズのWgによる中レベルのFirefly luciferase reporter活性を著しく高進させるdsRNAに対応する遺伝子を負の制御因子とした。
2 Drosophilaの全遺伝子に対応するdsRNAコレクションの作成
Eurogenetec社が合成したDrosophilaの全遺伝子に対応するdsRNA合成用鋳型DNA 19,470個を購入して使用した。MEGAscript T7 RNA polymerase kitを用いると500μgのdsRNAが得られた。
3 1次スクリーニングの実施
dsRNAが標的としている分子がWg経路の正あるいは負の制御因子である事を考慮して、スクリーニングはWg刺激の有、無しの両系にて行なった。
Microplateの各wellに個々のdsRNAを分注しておき、そこへreporterプラズミドとEffectene試薬の混合液を添加し、そこへ血清を含む完全培地で作ったS2R+細胞懸濁液を加えて、それを3日培養後Assayに供した。正の制御因子の新規の候補と考えられる遺伝子を148個、負の制御因子の新規の候補と考えられる遺伝子を32個得た。現在これらにつき解析中である。
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