| 研究課題/領域番号 |
17570118
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
機能生物化学
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| 研究機関 | 京都府立大学 |
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研究代表者 |
佐上 郁子 京都府立大学, 農学研究科, 教授 (10143033)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| 研究課題ステータス |
完了 (2006年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2006年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
2005年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
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| キーワード | 時計遺伝子 / ヘムタンパク質 / ガスセンサー / 転写因子 / ゲルシフトアッセイ / NADPH / PASタンパク質 |
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| 研究概要 |
1.ヘムドメインの部位特異的変異体の作成と解析による軸配位子の同定;NPAS2のPASAドメインのヘムの軸配位子と推定されるアミノ酸の部位特異的変異体を作成し、UVやラマンなど各種スペクトル解析を行ったところ、PAsAではHis119,His171が軸配位子である事が示唆された。2.NPAS2とBMAL1タンパク質のヘテロダイマー形成とDNA結合能の解析;精製した野生型NPAS2-bHLH/PASA、NPAS2-bHLH/PAS/PASBとBMAL1-bHLH/PASAを用いて、DNAへの結合能とヘテロダイマー形成能を調べるためのゲルシフトアッセイ系を開発し、解析した。NPAS2はBMAL1とヘテロダイマーを形成し、Per1遺伝子のプロモターに見られるカノニカルE-box配列(CACGTG)に特異的な結合活性を示した。一方、Per2遺伝子のプロモターに見られるE-box様配列(CACGTT)への結合は弱いものだった。3.さらにNPAS2-bHLH/PASAのPASAドメインに変異を持つタンパク質の5種の変異体の精製タンパク質を用いてDNA結合能を解析した。変異体のうちヘムの軸配位子を変異させた変異体では、DNA結合活性が見られなかった。またそれは、BMAL1とのヘテロダイマー形成が阻害されたためであることが示唆された。さらに変異体のDNA結合活性は、ヘム鉄の酸化状態が3価でも2価でも、またアポ酵素でも同様であった。4.NPAS2とBMAL1の転写活性制御のin vivo機能解析;NPAS2の転写因子としての活性を、ルシフェラーゼアッセイによって解析するために動物細胞系でのNPAS2とBMAL1の強制発現系とルシフェラーゼ遺伝子の上流にPer2のE-boxを挿入したreporter geneの構築を行い、転写活性をルシフェラーゼアッセイで解析する系を開発した。NPAS2のPASAドメインの各種の変異体の強制発現系を用いてマウスPer1、Per2遺伝子の転写活性を解析したところ、いずれの遺伝子の転写もヘム軸配位子の変異によって阻害された。
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