| 研究概要 |
土壌の微生物群集の解析には,培養することなく,直接抽出した核酸をPCR法で増幅して解析する手法が多く用いられている。しかし,この方法を植物根圏の微生物群集に適用する場合には,植物由来の核酸の混入が,障害となってくる。すなわち,特異的なPCRプライマーが存在しないため,微生物群集のSSUrDNAをPCR増幅する場合,同時に植物由来のSSUrDNAも増幅され,その解析が妨げられる。そこで,本研究では,植物根圏の微生物群集とくに糸状菌群の解析法を確立するため,PNAによるPCRクランピング法を組み合わせることにより,この障害を回避することを目的とした。
SSUrDNAの配列データベースが充実している細菌を対象として,群集解析に適用可能なPNAとして,植物ミトコンドリア特異的PNA(Mit1492)およびプラスチド特異的PNA(Pla1492)を作製した。これら2種類のPNAを用いた植物根圏の細菌群集構造解析法の有効性を確かめるために,土壌で栽培した植物根圏からビーズ法で直接抽出したDNAをサンプルとして,T-RFLP法にて根圏の細菌群集構造の解析をおこなった。従来のT-RELP法では,植物オルガネラSSU rDNAの大きなT-RFピークが細菌群集構造の解析を妨げた。一方,PNA-PCRクランピングによるT-RFLP法では,植物根由来のDNAの影響を受けることなく,細菌DNAのみを解析できることが確認できた。ここで確立した手法の糸状菌群集構造解析への適用を試みたが,糸状菌群集解析への適用については,糸状菌データデータベースの不十分さなどにより,適したPNAを作製することができなかった。
PNA-PCRクランピング技術は,植物根圏の微生物群集構造を解析する場合に,有効な手法であることが示されたが,糸状菌群集についてはさらに検討する必要性が示唆された。
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