| 研究概要 |
本申諸研究は,糖質加水分解酵素α-グルコシグーゼとその関速酵素を利用して,α型オリゴ糖の合成に適した新たなグリコシレーションテクノロジーの開発を目的とした.開発技術は具体的に次の2点,1)酵素の糖転移酵素化,2)特異性の改変,である.第1点により効率的なオリゴ糖合成マシーナリーを獲得し,第2点により合成オリゴ糖を多様化できる.得られた研究成果は以下の通りである.1.転移酵素化:オオムギa-アミラーゼ,Streptococcus mutansデキストラングルコシダーゼ,枯草菌由来オリゴ-1,6-グルコシグーゼ,などの酵素の触媒に必煩であり高度に保存されたアミノ酵残基の改変酵素を作製し,合成反応に使用した.反応条件の最適化により,一例として,有機合成したα型フッ化グルコースとマルトースから,三糖パノースを合成するシステムを開発した.野生型酵素で収率16%に対して,本システムでは71%と高い収率を示した.本システムに使用する変異酵素は加水分解活性を示さないので,安定的に高収率を得られる点に特徴がある.2.特異性の改変:基質特異性の改変酵素を作出した.デキストラングルコシグーゼでは,得られた立体構造のデータも併せて,基質の鎖長特異性,結合特異性(α1,6結合からα1,4結合へ)の変換に成功した.大腸菌YicIでは,キシロシドからグルコシドヘ特異性を改変した.3.その他,多様な酵素を得る目的で,イネ,ミツバチ等から多様なα-グルコシグーゼを精製し,性質ならびに配列解析,並びに組換え酵素生産を行った.イネα-グルコシダーゼは,特にデンプン粒結合・分解能を特徴とする.ミツバチα-グルコシグーゼは,3種のアイソザイムにより性質が大きく異なり,特にタイプIは高い糖転移能を示す.40%程度の配列保存性を示す.
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